免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒

免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒

产品及特点 福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织是疾病机制的回顾性临床研究中使用最为广泛的标本。但是由于它们的保存时间一般都比较长，很不容易从中提取到可以进行 PCR 的 RNA，存在的主要问题是 RNA 的降解和脱蜡过程中样品的丢失。本产品专门用来免提取释放切片核酸的试剂盒，它具有如下特点:
1. 免核酸提取，可以直接作为核酸扩增的模板。
2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或专一引物，适合各种情况。
3. PCR mix 含有上样染料，所以 PCR 产物可直接上样电泳。
4. 两管式操作，RT 和 PCR 分步进行，便于单独优化 RT 反应和 PCR 反应的条件。
5. 扩增效率高，最高可扩增 1kb 以上的 RNA。
6. 本试剂盒足够处理 30 次样品处理和 50 次的 RT-PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 阳性对照和阴性对照，RNase-free 的 1.5 mL 离心管（耗材） 
一、样品 RNA 的释放
1. 如果有 N 个样品，可设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用水作为制备的阴性对照，提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
2. 将 5 片厚度为 6-8 um 的石蜡包埋组织切片转移到 1.5 mL 塑料离心管(最好使用螺旋盖离心管)中并加入 1 mL 溶液 A，在振荡器上以最大速度振荡 10 秒，然后离心。
3. 取出上一步的上清液 0.6mL，加入 0.6mL 的溶液 B，震荡 5-10 秒。
4. 室温放置 10 分钟。
5. 混合液可以直接用做 PCR、RT-PCR、LAMP 和 RT-LAMP 扩增的模板。未用完的部分模板可以放-80℃长期保存。
二、RT（逆转录）反应合成 cDNA

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定 cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非 mRNA 的干扰。
7. 70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。
8. 按顺序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uL MMLV 逆转录酶（含RI），反应终体积为 20 uL。
9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
10. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。
11.合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。
三、PCR（30 uL 体系）
12.将全部专用染料加入到 PCR MagicMix 3.0 中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在 PCR 结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。

13.在 PCR 管中加入下列成分：

注意：cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍完全 取决于靶基因的丰度。

14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

四、电泳检测
15.取 5-10 uL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！