肌酐含量检测试剂盒（肌氨酸氧化酶法）可见分光光度法

肌酐（Cr）含量检测试剂盒说明书（肌氨酸氧化酶法）

 可见分光光度法

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前每支加入 1.7 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

2. 试剂二：临用前每支加入 1.65 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

3. 试剂三：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水（50T/48S），充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

4. 试剂三工作液：根据试验所需用量，按照试剂三：蒸馏水=1:9 的比例，充分混匀，现配现用。

5. 试剂四：临用前加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两个月。

6. 试剂五：临用前每瓶加入 3.4 mL 蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

7. 试剂六：临用前根据实验所需用量，按照试剂六 A 液：试剂六 B 液=1:1 的比例，充分混匀，现用现配。

8. 标准品：1 mg 肌酐。临用前加入 1 mL 蒸馏水，充分溶解，即 1 mg/mL 标准储备液，4℃保存 1 个月。临用前取 50μL 和 200μL 蒸馏水混合配制成 200μg/mL 的标准溶液备用，现用现配。

产品说明：

肌酐（creatinine，Cr），化学式是 C4H7N3O，是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。

肌酐在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢。过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在 505nm 有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔9秒，总时间5 min）；于4℃，12000g离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，混匀，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

2、组织样本的制备：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于 4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，混匀，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

3、血清（浆）：取 100 μL 血清（浆）加入 1 mL 提取液一，4℃，12000 g 离心 10 min，取 0.8 mL 上清液，再加入 0.15 mL 提取液二，混匀，4℃，12000 g 离心 10 min 后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 505 nm，蒸馏水调零。

2、 按下表步骤加样：

注：空白管只需做 1-2 次。

三、肌酐含量计算

1、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酐含量（μg/mg prot）= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×V 样÷（V 样×Cpr）=200×ΔA 测÷ΔA 标÷Cpr

（2）按照样本质量计算

肌酐含量（μg/g 质量）= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×（V 上清+V 提取液二）÷（W×V 上清÷V 提取液一）

= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酐含量（μg/10⁴cell）= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×（V 上清+V 提取液二）÷（细胞数量×V 上清÷V 提取液一）

= 237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酐含量（μg/mL）= C 标×ΔA 测÷ΔA 标×(V 上清+V 提取液二)÷ [V 液体×V 上清÷(V 提取液一+V 液体)]

= 2612.5×ΔA 测÷ΔA 标

C 标：标准管浓度，200 μg/mL；V 样：加入样本体积，60 μL=0.06 mL；V 上清：提取时上清液体积，0.8mL；V 提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V 提取液二：加入提取液二体积，0.15 mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以 10⁴计；V 液体：液体样本体积，0.1 mL。

注意事项：

1、提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取样本，即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞，用 1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆；取相同体积的血清（浆），用 1.206mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用 BCA 法进行蛋白浓度测定。

2、如果测定吸光值超过标准管吸光值，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果 ΔA 测定小于 0.01，建议增大样本量后再进行测定。

实验实例：

1、 取 0.1g 小鼠肌肉加入 1mL 提取液一进行匀浆研磨离心，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测=A 测定-A 空白=0.159-0.016=0.143，ΔA 标=A 标准-A 空白=0.373-0.016=0.357。按样本质量计算含量得：

肌酐含量（μg/g 质量）=237.5×ΔA 测÷ΔA 标÷W=951.3 μg/g 质量。

2、 取 100μL 牛血清加入 1mL 提取液一，取 0.8mL 上清后加 0.15mL 提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测=A 测定-A 空白=0.095-0.079=0.079，ΔA 标= A 标准-A 空白=0.373-0.016=0.357。按照液体体积计算含量得：

肌酐含量（μg/mL）= 2612.5×ΔA 测÷ΔA 标=578 μg/mL 血清。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！