α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性检测试剂盒 可见分光光度法

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 2.667mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂建议分装后-20℃保存一周，避免反复冻融。

2、标准品：5 μmol/mL 的对-硝基苯酚。

产品说明：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）属于糖基水解酶家族，可以从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个 L-阿拉伯糖分子。该酶在半纤维素降解以及果实的成熟软化过程中有着重要作用。

α-L-Af 分解对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚，对-硝基苯酚在 400 nm 处有最 大吸收峰，通过测定 400 nm 处吸光值变化可计算得 α-L-Af 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 15000 g，4℃，离心 10 min，取上清（若为绿色植物的茎、叶、芽等组织，建议将上清用提取液稀释 5 倍后检测；若为果肉等组织，上清可直接检测或根据预测定结果稀释相应倍数后检测）置于冰上待测。

2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万个细胞或细菌加入 1 mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 200 W，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3 min）；然后 15000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 400 nm，蒸馏水调零。

2、 将 5 μmol/mL 的对-硝基苯酚标准液用提取液稀释为 250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 nmol/mL 的标准溶液备用。

3、 操作表：(在 1.5 mL 离心管中)

三、α-L-Af 活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 ΔA 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y＝kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（nmol/mL）。

2、 α-L-Af 活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 蛋白每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/mg prot）= x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每 g 样本每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/g 质量）= x×V 提取÷W÷T= 2x÷W

（3）按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/10⁴ cell）= x×V 提取÷细胞数量（万个）÷T= 2x÷细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：每 mL 样本每小时产生 1 nmol 对-硝基苯酚为 1 个酶活力单位。

α-L-Af 酶活（U/mL）=x×V 样÷V 样÷T=2x

V 提取：提取液体积，1 mL；V 样：加入的样本体积，0.3 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5 h。

注意事项：

1、 A 或 ΔA 大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

2、 正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定，若浓度过高，建议将样本用提取液稀释适当倍数后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数；若浓度过低，建议在粗酶液提取时增加组织质量。

3、 加入试剂二后，建议 5 min 内读取 OD 值。

实验实例：

1、 取 0.1g 香蕉进行样本处理，取上清后，按测定步骤操作，测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.234-0.105=0.129，带入标准曲线 y=0.0037x+0.0029，计算 x=34.08，按样本质量计算酶活得：

α-L-Af 酶活（U/g 质量）=2x÷W=2×34.08÷0.1=681.6 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！