ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒 微量法

ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 500 μL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2、 试剂三：临用前加入 2 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前加入 0.5 mL 试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

5、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。

产品说明：

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶，其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料，并可参与相关重要蛋白的修饰作用，是体内能源物质代谢的枢纽性物质。

在ATP和辅酶A存在的情况下，ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐,，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、天平、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰盒。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。

2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min），于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。

3、血清（浆）或其他液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min。

3、 操作表 (在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入下列试剂) ：

三、ACL活性计算

A、按微量石英比色皿计算：

1. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位

ACL 活性（U/mg prot）=[ΔA×V 反总×10⁹÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL 活性（U/g 质量）=[ΔA×V 反总×10⁹÷（ε×d）]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照细胞数量计算

单位定义：每 1 万个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL 活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总×10⁹÷（ε×d）] ÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.215×ΔA

4. 按液体体积计算

单位定义：每 mL 液体每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V 反总×10⁹÷（ε×d）]÷V 样÷T=1607.7×ΔA

V 反总：反应总体积，2×10-4L；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；500：细胞或细菌数量，500 万。

B、按照 96 孔 UV 板计算将将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

实验实例：

1. 取 0.1g 黑麦草，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.7569-1.7034=0.0535，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0535-0.002=0.0515，按样本质量计算得：

ACL 活性（U/g 质量）=1607.7×ΔA÷W=827.9655 U/g 质量。

2. 取 0.1g 肝脏组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.2341-1.0503=0.1838，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1838-0.002=0.1818，按样本质量计算得：

ACL 活性（U/g 质量）=1607.7×ΔA÷W=2922.7986 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！