糖原磷酸化酶a（GPa）检测试剂盒微量法 微量法

糖原磷酸化酶 a(GPa)活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 0.5 mL 蒸馏水，充分混匀；

2、 试剂三：临用前加入 0.5 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前取一支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；1 瓶粉剂即可做 100T，为延长使用时间，故多给一支。

5、 试剂六：临用前取一支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；1 瓶粉剂即可做 100T，为延长使用时间，故多给一支。

6、 工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：蒸馏水=148μL:4μL: 4μL: 4μL: 10μL（1T 的量）的比例，充分混匀，现用现配。

产品说明：

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）：直接检测

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 临用前工作液置于 37℃预热 5min。

3、 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 样本、10 μL 试剂五、10 μL 试剂六、170 μL 工作液，充分混匀 10s，记录 340nm 处 10s 时吸光值 A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min（酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃），反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。

三、糖原磷酸化酶 a(GPa)活性计算

注意事项：

1、如果 ΔA＞0.6，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD

值，建议增加样本量后再进行测定。

实验实例：

1. 称取 0.1 g 兔子肝脏组织，加入 1 mL 提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心 10 min；取上清置于冰上待测。按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测定后计算 ΔA=A2-A1=0.3472-0.2253=0.1219，按公式计算活性：

GPa（U/g 质量）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=321.54×0.1219÷W=391.96 U/g 质量

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！