磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）检测试剂盒微量法 微量法

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性检测试剂盒说明书

微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 15 mL 试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

2、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 1：120 稀释，现用现配。

3、 试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 7：250 稀释，现用现配。

4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

5、 工作液的配制：将试剂二、试剂三、试剂四按 7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。

产品说明：

PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的第 一限速酶。

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。

3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂：

三、PEPCK酶活计算

注意事项：

1、 当 A1 小于 1 或 ΔA 大于 0.6 时（96 孔 UV 板是当 A1 小于 0.6 或 ΔA 大于 0.4 时），建议将样本稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。

2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织，建议将提取液稀释 5 倍或 5 倍以上测定。

3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.06。

4、 加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确。

实验实例：

1、 取 0.1g 肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释 2 倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.1298-0.4464=0.6834，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.6834-0.0356=0.6478，按样本质量计算酶活得：

PEPCK 酶活（U/g 质量）= 3215.4×ΔA÷W×2（稀释倍数）=3215.4×0.6478÷0.1×2=41658.72 U/g 质量。

2、 取 0.1g 芦荟加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.4015-1.2665=0.135，ΔA 空白管= A1 空白-A2 空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管=0.135-0.0356=0.0994，按样本质量计算酶活得：

PEPCK 酶活（U/g 质量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.0994÷0.1=3196.108 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！