线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒 微量法

线粒体复合体Ⅱ活性检测试剂盒说明书

微量法

规格: 100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：溶于 1 mL 丙酮，可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用。

2、 试剂三：临用前加入 2 mL 丙酮溶解备用。

3、 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三按 1：1 混合，现用现配。

产品说明：

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

2、 4 ℃ 600g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g离心15min。

3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4、 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅱ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。

3、 在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入：

三、复合体Ⅱ活力单位的计算

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2、 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

3、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

4、 本试剂盒试剂足够完成100管反应。

5、 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S）

实验实例：

1. 取0.1g兔子肾脏样本加入1mL提取液进行匀浆研磨离心，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得ΔA1=A1-A2=0.9851-0.7974=0.1877，ΔA2=A1-A2=1.2561-0.9659=0.2902，则按样本质量计算得：

上清中复合体II活性（U/g 质量）=476.2×ΔA1÷W =476.2×0.1877÷0.1=893.8274 U/g 质量

沉淀中复合体II活性（U/g 质量）=190.5×ΔA2÷W=190.5×0.2902÷0.1=552.831 U/g 质量

复合体II（U/g 质量）=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W =1446.658 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！