柠檬酸(CA)含量检测试剂盒 微量法

柠檬酸（CA）含量检测试剂盒说明书

 微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂三：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2、 试剂四：临用前取 1 支加入 1.5 mL 试剂一，充分溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。

3、 标准品：1 mmol/L 柠檬酸标准液。临用前用蒸馏水稀释成 250 μmol/L 柠檬酸标准液（将 25μL1 mmol/L柠檬酸标准液和 75μL 蒸馏水混合即可），现用现配。

产品说明：

技术指标：

最 低检出限：52.09 μmol/L

线性范围：62.5-6000 μmol/L

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、液体样本中柠檬酸提取：取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

2、组织中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

3、线粒体中柠檬酸提取：称约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，600g，4℃离心 5min；取上清至另一 EP 管中，11000g，4℃离心 10min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）；向沉淀中加试剂二 200μL，以及试剂三 2μL，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心 10min，取上清液，待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到545nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。

3、 操作表（按下表在1.5mLEP管/96孔板管中加入相应试剂）：

三、柠檬酸含量计算

注意事项：

1、样本处理等过程均需要在冰上进行。

2、试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。

3、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织进行测定。

4、若反应30min后有明显的黑色小颗粒，属于正常现象，需将样本稀释后再测。

5、如果样本吸光值大于0.7，建议将样本用试剂一稀释后进行测定。

实验实例：

1、 取 0.1g 冬青加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，11000g/min 4℃离心 10min，取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 A 测定管=0.220，A 空白管=0.114，A 标准管=0.146，按样本质量计算得：

柠檬酸含量（μmol/g 质量）=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4=33.13 μmol/g 质量。

2、 取 0.1g 大鼠肌肉组织加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，11000g/min 4℃离心 10min，取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 A 测定管= 0.347，A 空白管=0.114，A 标准管=0.146，按样本质量计算得：

柠檬酸含量（μmol/g 质量）=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4=72.81 μmol/g 质量。

3、 取 0.1mL 小鼠血清加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g/min 4℃离心 10min，取上清液 4 倍稀释后按照测定步骤操作，使用 96 孔板测得计算 A 测定管=0.201，A 空白管=0.114，A 标准管=0.146，按液体样本的体积计算：

柠檬酸含量（mmol/L）=2.5×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ×4=27.19 mmol/L。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！