线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测试剂盒 可见分光光度法

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格: 50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

产品说明：

线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1．称取约 0.3g 组织或收集 1500 万细胞，加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2．4℃，1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。

3．上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4．在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二，超声波破碎（功率 40%，超声 5 秒，间隔 9 秒，4min），4℃，10000g 离心 10 min，取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。

3、 操作表（在1.5 mLEP管中进行如下操作）：

三、ICDHm活性计算

1、标准曲线绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。

2、酶活力计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm酶活力（U/mg prot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×103=x÷Cpr×16.67V上清：加入上清液体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；T：反应时间，1h=60min；103：单位换算系数，1μmol =103nmol。

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

3、 附：使用样本重量计算公式

A、上清（胞浆）中ICDHm活力计算：

按样本质量计算

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=25.25×x÷W

V提取：加入提取液体积，1.515mL；V样：加入上清液体积，0.2mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

B、沉淀（线粒体）中ICDHm活力计算：

按样本质量计算

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=10.1×x÷W

V提取：沉淀重悬时加入提取液体积，0.606mL；V样：加入上清液体积，0.2mL；W：样本质量，g；T：反

应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

C、样本ICDHm总活力计算：

样本ICDHm总活力即为上清（胞浆）中ICDHm活力与沉淀（线粒体）中ICDHm活力之和。

按样本质量计算：ICDHm（U/g 质量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W

实验实例：

1、 取 0.3g 小鼠肾脏加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃，1000g 离心 10min。

将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物，在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二，超声波破碎，4℃，10000g 离心 10min，取上清液，分别按操作步骤检测，测得：胞浆 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=0，线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.767-0.475=0.292，带入标准曲线y=1.0917x+0.0471 计算相应的 x 值，按样本质量计算酶活得：胞浆中 ICDHm 活性（U/g 质量）=25.25×x÷W=0U/g 质量，线粒体中 ICDHm 活性（U/g 质量）=10.1×x÷W=7.55 U/g 质量，样本总 ICDHm（U/g 质量）

=25.25×x÷W+10.1×x÷W=7.55 U/g 质量。

2、 取 0.3g 小化眉加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃，1000g 离心 10min。

将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物，上清液稀释 2 倍，在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二，超声波破碎，4℃，10000g 离心 10min，取上清液稀释 2 倍，分别按操作步骤检测，测得：胞浆 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0，线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.635-0.487=0.148，带入标准曲线 y=1.0917x+0.0471 计算相应的 x 值，按样本质量计算酶活得：胞浆中 ICDHm 活性（U/g 质量）

=25.25×x÷W×2=15.49U/g 质量，线粒体中 ICDHm 活性（U/g 质量）=10.1×x÷W×2=2.28 U/g 质量，样本总 ICDHm

（U/g 质量）=25.25×x÷W×2+10.1×x÷W×2=15.49 U/g 质量。

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