柠檬酸(CA)含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
产品说明:
CA是生物体内常见的有机酸,是重要的食品风味物质。此外,CA是三羧酸循环第一步反应的产物。酸性条件下,柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+,在545nm处有特征吸收峰;通过测定545nm吸光值的增加,即可计算出样本中柠檬酸含量。
技术指标:
低检出限:19.93 μmol/L
线性范围:31.25-4000 μmol/L
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、液体样本中柠檬酸提取:取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g/min 4℃离心 10min,取上清液,待测。
2、组织中柠檬酸提取:称约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g/min 4℃离心 10min,取上清液,待测。
3、线粒体中柠檬酸提取:称约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,600g/min 4℃离心 5min;取上清至另一 EP 管中,11000g/min,4℃离心 10min,弃上清(此上清液可用于细胞质 CA 含量测定);向沉淀中加试剂二 200μL,以及试剂三 2μL,充分悬浮溶解,11000g/min,4℃离心 10min,取上清液,待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长到545nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一置于30℃水浴中预热30min以上。
3、 操作表(按下表在1.5mLEP管中加入相应试剂):
三、柠檬酸含量计算
1、按液体样本的体积计算
柠檬酸含量(mmol/L)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×F
=2.5×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)
C标准液:标准品的浓度,250μmol/L=0.25mmol/L;F:样本稀释倍数,(0.1mL样本+0.9mL试剂一)÷0.1mL样本=10。
2、按组织质量计算:
柠檬酸含量(μmol/g 质量)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W
=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷W
C标准液:标准品的浓度,250μmol/L;V总:上清液总体积,1.0mL=0.001L;W:样本质量,g。
3、按线粒体蛋白浓度计算:
柠檬酸含量(μmol/mg prot)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)] ×V样÷(Cpr×V样)
=0.25×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管) ÷CprC标准液:标准品的浓度,250μmol/L=0.25μmol/mL;V样:加入的样本体积,100μL=0.1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
1、样本处理等过程均需要在冰上进行。
2、试剂五为易致癌物质,实验过程中,需佩戴手套,避免试剂五溅到皮肤上。
3、柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定,如需测定蛋白含量,需另取组织进行测定。
4、若反应30min后有明显的黑色小颗粒,属于正常现象,需将样本稀释后再测。
5、如果样本吸光值大于0.8,建议将样本用试剂一稀释后进行测定。
实验实例:
1、 取 0.1g 冬青加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g/min,4℃离心 10min,取上清液稀释 4 倍之后按照测定步骤操作,测得 A 测定管=0.343,A 空白管=0.107,A 标准管=0.162,按样本质量计算得:
柠檬酸含量(μmol/g 质量)=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4(稀释倍数)=42.91
μmol/g 质量。
2、 取 0.1g 大鼠肌肉组织加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,11000g/min,4℃离心 10min,取上清液稀释 4 倍之后按照测定步骤操作,测得计算 A 测定管=0.645,A 空白管=0.107,A 标准管=0.162,按样本质量计算得:
柠檬酸含量(μmol/g 质量)=0.25×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W×4(稀释倍数)=97.82
μmol/g 质量。
3、 取 0.1mL 小鼠血清加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g/min,4℃离心 10min,取上清液稀释 4 倍之后按照测定步骤操作,测得计算 A 测定管= 0.347,A 空白管=0.107,A 标准管=0.162,按液体样本的体积计算:
柠檬酸含量(mmol/L)=2.5×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)×4(稀释倍数)=43.64 mmol/L。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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