IPHASE/汇智和源 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验热点问题解答【上】

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验常见问题与解答

—热点问题—

第一题    细胞被“黑胶虫”污染了该如何处理？

如果培养的细胞被“黑胶虫”污染，需先去评估污染的严重程度。如果污染不严重，可选用市售的“黑胶虫”清除试剂进行处理；如果污染较严重，建议直接丢弃该细胞，分析造成“黑胶虫”污染的原因并进行治理。

第二题    CHL细胞为试验系统，细胞准备时推荐的接种密度是多大？接种后培养多久可以开始染毒？

本公司使用T25瓶进行试验，接种密度为6~9×10^4/mL，接种量为5mL，即每瓶细胞量是3×10^5个~4.5×10^5个。一般情况下，接种后24h左右细胞的融合率可达到80%即可进行染毒，如果融合率不够，也可以继续培养直至满足试验需求。

第三题    一般如何确定秋水仙素的浓度和处理时间啊？

秋水仙素剂量大，则作用时间短；秋水仙素剂量小，则适当延长作用时间。本公司使用的秋水仙素浓度是1μg/mL，4h。

第四题    秋水仙素工作的机理是什么？

秋水仙素可以抑制纺锤体的形成，导致纺锤丝无法捕捉到着丝粒而造成染色体不能向细胞两极移动。同时，秋水仙素处理后，染色体将会不能排列在赤道板，所以在细胞中会散乱分布。

第五题    细胞收集量少是什么原因导致的？如何优化？

细胞收集量少的原因主要有以下几点：

（1）酶消化过程消化不干净；

（2）离心速度过低，细胞不能沉淀，导致细胞丢失；

（3）铺板细胞量不够；

（4）样品对细胞有毒性，细胞死亡。

优化策略：

（1）酶消化过程需于显微镜下观察，确保消化完全；

（2）适宜的离心条件，通常250g，5min;

（3）细胞悬液需混合均匀，必要时多次计数；

（4）如有需求，请于正式试验前开展预试验。

第六题    低渗目的是什么？有什么注意事项？

在低渗环境中，细胞易吸水膨胀，染色体铺展，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，为后续染色做准备。在低渗过程中我们需要注意以下几点：

（1）低渗时间。低渗时间过长，可引起细胞破裂，染色体丢失；低渗时间不足，细胞膨胀度不够，染色体聚集，分散不好，不利于阅片。本公司低渗是使用0.075mol/L的氯化钾溶液37℃水浴30~40min。

（2） 细胞操作需轻柔。低渗后的细胞会胀大，通透性增强，细胞操作过程一定要轻柔，以防细胞破裂。

（3）离心条件需适合。低渗后细胞膨胀，离心力过高，细胞容易破裂，导致染色体丢失；离心力过低，细胞不能沉淀，收集不到细胞。

第七题    细胞在固定过程中丢失是什么原因导致的？

细胞在固定过程中丢失可能是因为离心速度过低，细胞不能沉淀或沉淀不够，在更换固定液的过程中导致细胞丢失。

第八题    每次固定的时间是多久？固定几次比较合适？

本公司使用的是预固定加重复固定的方法。预固定在低渗结束前进行，一般3~5min，步骤虽简单却不能省略，可有效预防细胞因加入大量的固定液而凝结成块。固定步骤共重复3次，一般30±5min。

第九题    玻片干燥怎么操作？

可于室温下自然干燥，也可于37℃干燥箱中烘干。

第十题    使用吉姆萨染液同样条件下染片，为什么会出现有的片子是蓝色的，有的是红色的？

根本原因是因为染色过程中pH的变化。吉姆萨染液由天青，伊红组成，所带电荷随溶液PH而定。在偏酸性环境中下在电荷增多易与伊红结合染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多,易与美蓝或天青结合,染色偏蓝。

汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。