大豆慢生根瘤菌的形态与培养特征及注意事项有哪些？

               大豆慢生根瘤菌的形态与培养特征及注意事项有哪些？

大豆慢生根瘤菌是Bradyrhizobium属的微生物，原产地为中国。主要用途为研究；教学，具体用途为用于分类学和遗传学研究，教学上也有应用，同时也筛选与豆科植物共生固氮的高效菌株用于实际生产。

一、菌种简介

平台编号：Bio-16555

提供形式：斜面培养物

英文名称：Bradyrhizobium japonicum

中文名称：大豆慢生根瘤菌

属名：Bradyrhizobium

种名加词：japonicum

来源历史：←中国农业科学院土壤肥料研究所←1990年从广东惠阳山地黄壤沙土（pH4.27）采集大豆

原始编号：729

原产国：中国

资源归类编码：15131119101

模式菌株：非模式菌株

主要用途：a:2:{i:0;s:4:研究;i:1;s:4:教学;}

具体用途：与大豆共生固氮,培养基pH4.7生长

生物危害程度：四类

致病对象：无

培养基编号1：63

资源保藏类型：a:1:{i:0;s:6:培养物;}

保存方法：a:2:{i:0;s:14:真空冷冻干燥法;i:1;s:8:矿物油法;}

共享方式：a:5:{i:0;s:10:公益性共享;i:1;s:16:资源纯交易性共享;i:2;s:12:合作研究共享;i:3;s:14:行政许可性可享;i:4;s:14:资源交换性共享;}

用途：与大豆共生固氮,培养基PH4.7生长

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）        

二、个体形态特征

有鞭毛，运动，有夹膜，革兰氏阴性，无芽孢的小杆菌，内含PHB，裂殖。

三、培养特征

圆形、乳白色、圆形中突菌落，半透明，边缘整齐，有较多粘液，培养5-7天菌落直径达2-3mm，可以液体培养。

四、生理生化特征

化能有机营养型，需氧，不需要光照，PH中性、28℃生长良好。碳源利用（不利用己二酸、D-(-)-果糖、D-(+)-半乳糖、D-阿拉伯糖、甲酸钠、糊精、半乳糖醇、内消旋赤鲜醇、葡萄糖、菊糖、乳糖麦芽糖、蜜二糖、D-(+)-松三糖、D-(+)-甘露糖、绵子糖、L-鼠李糖、水杨素、山梨糖醇、山梨糖、淀粉、蔗糖、丁香酸、香草酸；利用D-(+)-阿糖醇、肌醇、葡萄糖酸钙、马尿酸钠、海藻糖、丙二酸钙、DL-苹果酸钙、丙酮酸钠、D-核糖、乙酸钠、柠檬酸钠、D-葡萄糖酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钾钠、木糖），氮源利用（不利用DL-精氨酸、L-异亮氨酸、DL-天冬酰氨、L－甘氨酸、L-甲硫氨酸、羟脯氨酸、L-苏氨酸、DL-丙氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、D-谷氨酸、L-甲硫氨酸、D-苏氨酸、D-缬氨酸；利用L-(-)-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-(+)-谷氨酸、次黄嘌呤、L-苯丙氨酸），抗生素敏感性（耐氨苄青霉素5ug/ml，耐氯霉素300ug/ml，耐红霉素100ug/ml，耐卡那霉素5ug/ml，耐新霉素100ug/ml。

五、培养方法

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。工业发酵的有用菌种,其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种,也称种子制备,是指菌种在一定条件下,经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯 菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的菌种,用无菌手续挑取少许,接入琼脂斜面培养基上,在25℃(或较高温度)下培养5~7天(或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子(对于霉菌类孢子制备,多数采用大米、小米之类的天然培养基)。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液,接种到扁瓶固体培养基上,于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干,使水分降至10%以下,并放入4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在 上延续使用半年左右。

6、如果有些菌种不产孢子,如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体,作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖)和氮源(如玉米浆),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3ml 的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支斜面或平板；或直接接种液体培养基，以不超过 5ml 为宜）；

2）经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；二次接种量要多，固体斜面培养基水分要少才能让菌体长得比较明显，液体培养要静止培养；

3）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

4）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

5）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

6）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降或者不活等情况，请在收到菌种后2 个月内联系，逾期不予受理；

7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛；

8）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作；

9）甘油管使用：使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降；

10）西林瓶开封：用 75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖， 注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用 75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入 0.5ml 适宜的液体培养基复溶冻干粉末。

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