大鼠肝实质细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                   大鼠肝实质细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

大鼠肝实质细胞是指大鼠肝脏中的主要功能细胞，也称为肝细胞。这些细胞占据了肝脏的大部分体积，并承担着多种重要的生理功能，包括代谢、解毒、合成和分泌等。

大鼠肝实质细胞在实验室研究中常被用作模型来探讨肝脏疾病、药物代谢和毒理学等方面的问题。它们可以通过原代培养或传代培养的方式获得，并用于各种体外实验。

原代培养是指从大鼠肝脏中直接分离出肝细胞并进行培养。这种方法可以保持细胞的原始特性，但细胞寿命相对较短，通常只能进行有限次数的传代。传代培养则是将原代培养的肝细胞进行传代扩增，使其能够在实验室中长期保存并进行反复实验。然而，传代培养的大鼠肝实质细胞可能会逐渐失去某些原始特性。

大鼠肝实质细胞在培养过程中需要特定的培养基和条件来维持其生长和功能。通常，这些细胞需要在含有适当比例的胎牛血清（FBS）、抗生素和生长因子的培养基中进行培养。同时，细胞培养的环境也需要保持恒定的温度、湿度和二氧化碳浓度。

大鼠肝实质细胞具有多种功能，包括合成和分泌蛋白质、代谢碳水化合物、脂肪和药物等。因此，它们常被用于研究肝脏的代谢途径、药物代谢和毒理学等方面。此外，这些细胞还可以用于评估药物对肝脏的潜在毒性以及开发新的治疗策略。

二、大鼠肝实质细胞培养操作

1)复苏大鼠肝实质细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠肝实质细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠肝实质细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

大鼠肝实质细胞可以用于葡萄糖对大鼠肝细胞白蛋白基因表达的影响：

首先观察大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况,建立实验细胞模型。进一步观察不同浓度葡萄糖对大鼠肝实质细胞白蛋白基因表达的影响。

方法：

(1)原位二步Ⅳ型胶原酶灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝细胞与Kupffer细胞;体外进行肝细胞单独培养、大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞按6:1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,每隔24h检测培养上清中白蛋白和ALT、AST的水平,并在36h放免法检测上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量。

(2)用终浓度分别为3.9mmol/L,7.0mmol/L,11.1mmol/L,22.2mmol/L的葡萄糖处理联合培养体系,以3.9mmol/L组作为对照组,分别于4h、24h留取细胞上清液,全自动生化仪检测白蛋白浓度,放免法检测上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量,提取大鼠肝实质细胞RNA及逆转录聚合酶链法(RT-PCR)检测白蛋白mRNA含量。

结果：

(1)单独培养组大鼠肝实质细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至15d;共同培养组肝细胞细胞生长增殖缓慢,细胞可培养存活至10d。混合培养组上清白蛋白水平在24、36、48、60h比单独培养组低(t=2.980,3.139,2.551,2.605;p<0.05);混合培养组上清ALT、AST水平在24、36、48、60h高于于单独培养组(ALT t=3.055,2.666,2.824,3.108;p<0.05;AST t=2.632,2.446,3.090,2.895;p<0.05),联合培养组Kupffer细胞保持IL-1、IL-6和TNF-α分泌功能,而单独培养组未检测到IL-1、IL-6和TNF-α。

(2)不同浓度葡萄糖处理大鼠肝实质细胞4h后,各组肝细胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平与对照组相比差异无统计学意义,与此同时,各组肝细胞上清中白蛋白水平与肝细胞白蛋白mRNA表达与对照组相比下降不明显;而培养24h以后,各组肝细胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平与对照组相比上升明显,并且,随着葡萄糖浓度的增加肝细胞上清中IL-1,IL-6,TNF浓度不断上升,并且呈现剂量依赖关系,各组肝细胞上清中白蛋白水平与肝细胞白蛋白mRNA表达与对照组相比下降明显,呈现剂量依赖关系,与肝细胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平变化一致。

结论：

(1)大鼠肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养,kupffer细胞分泌细胞因子的功能和肝细胞白蛋白合成分泌功能保持良好,可用于实验研究。

(2)高浓度葡萄糖糖能促进Kupffer细胞释放IL-1、IL-6和TNF-α,间接抑制大鼠肝细胞白蛋白mRNA的表达。

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