小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒的操作步骤及应用研究！

              小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒的操作步骤及应用研究！

一、背景

小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒是一种用于特异性地高灵敏地定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的CRP的酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒。CRP，即C-Reactive Protein，是一种非糖基化蛋白，属于正五聚蛋白家族，其主要功能是作为先天性免疫反应的传感器和活化剂。

二、在使用小鼠C反应蛋白（CRP）Elisa试剂盒时，需要遵循以下步骤：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4、每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6、依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

三、应用

小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒可以用于血清超敏C反应蛋白与骨质疏松症的关系研究：

研究对象血清hs-CRP值采用小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)进行检测。采用多元logistic回归分析估算血清hs-CRP水平与老年人群患骨质疏松的相对危险度OR(odds ratio)值及95%可信区间(confidence interval,CI)。

基础实验部分主要选取8月龄的以C57BL/6J为背景的Nur77基因敲除鼠作为血清hs-CRP偏高的实验组,同窝的野生型小鼠作为血清hs-CRP正常的对照组进行研究。小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒酶联免疫吸附试验(Elisa)用于检测小鼠血清中超敏C反应蛋白(hs-CRP)和白介素6(Interleukin-6,IL-6)的变化情况。micro-CT用于检测Nur77基因敲除鼠和对照组鼠股骨骨小梁微结构的变化,H&E染色和TRAP染色分别用于观察股骨骨小梁微结构的变化和破骨细胞数量和活性的变化。股骨中炎症相关蛋白表达水平的变化主要通过western blot实验检测,炎症相关和破骨细胞生成相关因子转录水平的变化情况主要通过real-time PCR进行检测。

小鼠C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒结果:本研究共纳入4010名60岁及以上老年人,其中男性1660名(41.4%),女性2350名(58.6%),平均年龄68.9岁,骨质疏松患者共1203位,非骨质疏松症患者共2807名,骨质疏松症的患病率为30.0%,其中男性研究对象骨质疏松症的患病率为27.7%,女性明显高于男性为31.6%(P=0.008)。60-69岁年龄组共纳入研究对象2568名,骨质疏松症患病率为26.6%,70-79岁年龄组共纳入研究对象1078名,骨质疏松症患病率为33.6%,80岁及以上年龄组共纳入研究对象364名,骨质疏松症患病率43.7%。研究对象血清hs-CRP的中位数水平为0.95mg/L,血清hs-CRP水平低于中位数水平者骨质疏松症的患病率为25.1%,大于等于中位数水平者骨质疏松症的患病率为34.9%,两组的差异具有统计学意义(P<0.001)。

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