JM109感受态细胞的背景与应用及制备方法！

                      JM109感受态细胞的背景与应用及制备方法！

一、背景

JM109感受态细胞是通过理化方法诱导JM109细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的状态。JM109感受态细胞是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

二、制备方法

（一）CaCl2法

1、将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

2、此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3、将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

（二）电转法

电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。

M109菌株来源于E.coli K strain，是提取高质量DNA的理想菌株，recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。携带hsdR17基因型背景，使得异源DNA不被内源核酸酶系统降解。laqI qZΔM15的存在使JM109可用于构建克隆，蓝白斑筛选实验；

JM109感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达109cfu/μg DNA。

三、应用

用于高保真酶介导的突变敏感性分子开关用于三种常见遗传性疾病分子诊断的研究：

mtDNA12S rRNA基因PCR产物克隆至pMD19-T载体，转化E.coli JM109感受态细胞，通过LB/Amp/IPTG/X-gal平板筛选白色克隆，载体通用引物对其进行菌液PCR扩增初步确定阳性克隆，并通过序列分析进行确证，得到mtDNA12S rRNA基因的野生模板质粒。反向PCR对其野生质粒模板实施体外mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T定点突变，Dpn I内切酶降解甲基化的野生质粒DNA模板后，再次转化E.coli JM109感受态细胞，同前筛选阳性克隆，测序鉴定得到mtDNA12SrRNA基因C1494T和A1555G突变质粒模板。进一步设计与mtDNA12S rRNA基因A1555G和C1494T突变位点配对及三末端不配对的3’硫化修饰正向引物，在其下游设计一条公共反向引物，分别构成野生检测引物与突变检测引物，对mtDNA12SrRNA基因野生质粒模板和A1555G和C1494T突变质粒模板，进行高保真DNA聚合酶介导的双向引物延伸反应，利用凝胶成像系统对其PCR结果进行分析。

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