溶血性链球菌检验的主要内容与适用范围及操作步骤！

                溶血性链球菌检验的主要内容与适用范围及操作步骤！

1、主题内容与适用范围

本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球的检验。

2、引用标准

GB  4789.28  食品卫生微生物学检验  染色法、培养基和试剂

3、设备和材料

3．1  温箱：36±1℃。

3．2  水浴：36±1℃。

3．3  显微镜。

3．4  离心机。

3．5  试管架。

3．6  灭菌平皿。

3．7  灭菌小试管。

3．8  载玻片。

3．9  灭菌吸管：1 mL、10 mL。

3．10  灭菌镊子。

3．11  均质器。

3．12  酒精灯。

3．13  接种环。

4、培养基和试剂

4．1  葡萄糖肉浸液肉汤：按GB  4789.28 中 4.1 规定，在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。

4．2  肉浸液肉汤：按 GB 4789.28 中 4.1 规定。

4．3  匹克氏肉汤：按 GB 4789.28 中 4.62 规定。

4．4  血琼脂平板：按 GB 4789.28 中 4.6 规定。

4．5  人血浆。

4．6  0.25%氯化钙。

4．7  灭菌生理盐水。

4．8  杆菌肽药敏纸片（含 0.04 单位）。

5、检验程序

6、操作步骤

6．1  样品处理

称取 25 g 固体检样；称取 25 mL 液体检样，加入 225 mL 灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

6．2  一般培养

将上述混悬液吸取 5 mL，接种于 50 mL 葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经 36±1℃培养 24 h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

6．3  形态与染色

本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1  µm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者 20～30 个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。  

6．4  培养特性

该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75  mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有 2～4  mm 界限分明、无色透明的溶血圈。

6．5  链激酶试验

致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶） ，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。 吸取草酸钾血浆 0.2  mL，加0.8  mL 灭菌生理盐水，混匀，再加入 18～24  h36±1℃培养的链球菌培养物 0.5 mL 及 0.25%氯化钙 0.25 mL（如氯化钙已潮解，可适当加大至 0.3%～0.35%） ，振荡摇匀，置于 36±1℃水浴中 10 min，血浆混合物自行凝固（凝固程序至试管倒置，内容物不流动） 。然后观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如 24 h 后不溶解即为阴性。

草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01 g 放入灭菌小试管中，再加入5 mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。

6．6  杆菌肽敏感试验

挑取乙型溶血性链球菌液， 涂布于血平板上， 用灭菌镊子夹取每片含有 0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于 36±1℃培养 18～24  h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。

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