微生物菌种的代码与复苏及保藏方法与注意事项！

                   微生物菌种的代码与复苏及保藏方法与注意事项！

一、菌种代码的意义

国内常见微生物检验所用的菌种代号是：

CMCC（F）或 CMCC（B）

CMCC —— 中国医学菌种保藏中心

B —— 代表细菌

F ——代表真菌

大肠杆菌：CMCC (B) 44102；

乙型副伤寒沙门杆菌：CMCC (B) 50094；

铜绿假单胞菌：CMCC (B)10104；

金黄色葡萄球菌：CMCC (B)26003；

生孢梭菌：CMCC(B)64941；

白色念珠菌：CMCC(F)98001。

二、菌种的复苏

按照菌种的使用说明将复苏液在超净工作台或生物安全柜内进行复苏。

三、常用菌种保藏方法

1、琼脂斜面低温保存法

（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月传代一次。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年至一年。

（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。

（3）特点：优点是简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用；缺点是保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。

（4）注意事项：

a.保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

b.保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。

c.每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。

d.保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于 2 %为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。

e.铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液体石蜡保存法

（1）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或 110~ 170 ℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1cm为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。

（2）适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。

（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。

（4）注意事项：

a.保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。

b.使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。

c.将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染.

d.液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1cm为宜。

e.制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

3、磁珠保存法

将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃棉，再放上10~20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。

本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。

磁珠保存时间更长，使用方便，大大减轻操作人员的工作。

四、常用菌种保藏方法

方法一：斜面传代

冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入超净工作台或生物安全柜。

点燃酒精灯（灭菌器），用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住试管塞，拨开试管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。

堵上试管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开试管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。

取出接种棒，在火焰旁将试管塞堵上，然后将接种棒在火焰上烧灼灭菌。

将已接种完的斜面置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转种一次。

 方法二：斜面-营养肉汤-分离平板-斜面

用接种环取上述斜面菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支，已灭菌)，置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液，接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。

常用分离平板：

大肠埃希菌——EMB琼脂平板；

铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基；

金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基。

五、菌种保管

菌种保管应有专人负责，双人双锁，确保菌种安全。

菌种领用、传代、保存都要有记录，包括名称、入库、领用、传代日期、鉴定者、主要鉴定性能及灭活或销毁情况。

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