肺炎链球菌的实验室检查与诊断及安全防护！

                     肺炎链球菌的实验室检查与诊断及安全防护！

一、知识简介

肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。

二、生物学性状

1、形态与染色

典型的肺炎链球菌为革兰染色阳性球菌，直径约1μm。常呈双排列。有毒株在体内形成荚膜。普通染色时荚膜不着色，表现为菌体周围透明环，无鞭毛，不形成芽胞。菌体衰老时，或由于自溶酶( autolysin)的产生将细菌裂解后，可呈现革兰染色阴性。

2、培养特性

需氧或兼性厌氧。在固体培养基上形成小圆形、隆起、表面光滑、湿润的菌落。培养初期菌落隆起昰穹隆形，随着培养时间延长，细菌产生的自溶酶裂解细菌使菌落中央凹陷，边缘隆起成“脐状”。肺炎链球菌在血琼脂平板上菌落周围形成α溶血环。培养基中加入5%~10%CO2可促进细菌的生长。奥普托欣（Optochin）可抑制肺炎链球菌生长。

3、生化反应

大多数新分离出的肺炎链球菌可发酵菊糖，故菊糖发酵试验在鉴别肺炎链球菌与甲型溶血性链球菌时有一定的参考价值。

4、抗原构造与分型

荚膜多糖抗原存在于肺炎链球菌荚膜中。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎链球菌分为84个血清型，其中1~3型致病力强，主要引起人类大叶性肺炎。

5、抵抗力

抵抗力较弱，56℃15~30分钟即被杀死。对一般消毒剂敏感。有荚膜株抗干燥力较强。对青霉素、红霉素、林可霉素等敏感。

三、检查及诊断

（一）实验室检查

1、标本采集

包括痰、脓液、血液、脑脊液等标本。

2、细菌学检查

痰直接涂片作革兰染色及荚膜染色镜检，如有革兰阳性、带荚膜的双球菌或链球菌，可做出初步病原诊断。痰培养24-48小时可确定病原体。10%-20%患者合并菌血症，应做血培养，血培养检出肺炎链球菌有确诊价值。聚合酶链反应(PCR)检测及荧光标记抗体检测可提高病原学诊断水平。

3、分离培养

常采用羊血平板，有助于其溶血特征的识别和进一步鉴定，而且初代分离应置5%~10%CO2的环境下培养。在血平板上，肺炎链球菌的菌落直径0.5~1.5mm，灰白色、半透明、表面光滑（有些菌株可表现为粘液状）扁平，周围环绕着草绿色溶血环。培养或放置24h以上的培养物还会由于肺炎链球菌的自溶作用而致菌落中央塌陷而边缘隆起，而呈脐窝状。

4、鉴定试验

①胆汁溶菌试验：本试验的原理基于胆盐能够通过活化肺炎链球菌的自溶酶而溶解肺炎链球菌，但不能溶解草绿色链球菌。常用的方法包括快速平板法和标准试管法。前者取一接种环2%去氧胆酸钠溶液加于血平板待鉴定菌的菌落上，置35℃孵育15~30min，菌落溶解消失为阳性。而后者则是在1ml待鉴定菌18~24h培养液中加入2滴10%去氧胆酸钠溶液，35℃孵育5-10min后鉴定菌管由混浊变为透明者为阳性。

②奥普托欣（Optochin）试验：用以与其他草绿色链球菌相鉴别。用接种环将单个待鉴定菌落均匀涂于血平板上，用含量为5μg的optochin纸片贴于接种区中央，35℃需氧培养过夜，抑菌圈 >18mm的为阳性。本菌为阳性。

5、小鼠毒力试验

若用有毒力的菌株接种小鼠，接种后12-36h，小鼠死亡。

（二）血常规检查

白细胞计数升高，中性粒细胞比例多>80%，并有核左移，细胞内可见中毒颗粒。年老体弱、酗酒免疫功能低下者可仅有中性粒细胞增多。

（三）胸部X线检查

呈多样性，早期仅见肺纹理增粗，或受累的肺段、肺叶稍模糊。随着病情进展，可呈斑片状或大片状实变阴影，在病变区可见多发性蜂窝状小脓肿，叶间隙下坠消散期，因炎性浸润逐渐吸收，可有片状区域吸收较快而呈现“假空洞”征。一般起病3-4周后才完全消散。

（四）诊断要点

根据寒战、高热、胸痛、咳铁锈色痰、鼻唇疱疹等典型症状与肺实变体征，结合胸部Ⅹ线检查，容易做出初步诊断。病原菌检测是本病确诊的主要依据。

四、安全防护

根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录（待颁布）肺炎链球菌属于三类，BSL-2。相关的防护事宜包括：

（一）操作要求

1、实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。

2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

3、所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。

4、对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。

5、注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。

6、打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。

7、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。

8、溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。

9、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。

（二）安全设备

1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。

2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。

3、涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。

4、当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。

5、在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。

6、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。

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