大鼠骨膜干细胞的运输和保存及培养操作规程！

                    大鼠骨膜干细胞的运输和保存及培养操作规程！

一、细胞简介

平台编号：Bio-132450

规格：5×10⁵Cells/T25培养瓶

细胞信息：原代细胞

细胞名称：大鼠骨膜干细胞

细胞用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞详述

骨膜是覆盖在骨质表面的一层结缔组织。骨膜通过夏皮式纤维锚定在骨质上，充当外部肌肉组织和内部骨质的连接桥梁，这种结构有助于维持骨膜的完整性。

骨膜由两部分组成，外层疏松的纤维层与内层致密的细胞层，纤维层中含有成纤维细胞、胶原纤维、弹力纤维及微管等。细胞层中多为骨膜源干细胞，这种干细胞与骨髓来源的间充质干细胞类似，具有多向分化的潜能。

骨质修复、重塑和更新与骨膜中的干细胞密切相关。在正常生理状况下，骨膜组织发挥着维持骨质更新及重塑的作用，其中的干细胞既可以通过膜内成骨方式分化为成骨细胞，也可通过软骨内成骨方式分化为软骨细胞。

三、细胞特性

1)细胞来源于实验动物正常关节骨膜组织。

2)细胞鉴定：CD90或CD73免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：成纤维样细胞，贴壁培养。

四、产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

五、产品使用

1)本产品仅能用于科研

2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核

3)本产品未通过用于活体诊断的审核

六、细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

4）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

5）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

6）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 1：2 传代。

七、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备 MEGM kit 培养基 （Lonza/Clonetics,CC-3150）备注：培养基包含（A+B）

A：MEBM 基础培养液

B: 细胞生长添加剂 5 管 5 管

霍乱毒素（cholera toxin） (100ng/ml) 500 ul

P/S 青霉素-链霉素 5 ml

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37 摄氏度，培养箱湿度为 70%-80%。

3）冻存液：92.5%完全培养基，7.5%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入 4mL 培养基混合均匀。在 800-1000RPM 条件下离心 4-5 分钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入 T25 培养瓶中培养，补加培养基至 6ml。24-48h 后换液。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2.加 1ml 消化液（0.25%Trypsin）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加 1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加 1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按 1：3 到 1:4 比例分到新的含 6ml 培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为 1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面 T25 瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入 1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 完全培养基重悬细胞，根据细胞数量加入 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 7.5%，细胞密度 1-2xE6/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

八、注意事项

1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

2、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

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