TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系的应用与培养操作！

                        TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系的应用与培养操作！

一、背景

TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系是一种来源于小鼠肾小管上皮细胞的细胞系，常用于研究肾脏疾病的发生机制、药物筛选和毒性评价等。该细胞系具有以下特点：

来源：TCMK-1细胞系来源于小鼠肾小管上皮细胞，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。

形态特征：TCMK-1细胞呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。

生长特性：TCMK-1细胞生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中稳定生长。

特异性标志物：TCMK-1细胞表达多种特异性标志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鉴定其肾小管上皮细胞特性。

其他特性：TCMK-1细胞还具有一定的增殖能力，可用作研究肾脏疾病发生机制和药物筛选的模型。

二、TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系培养操作

1)复苏TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系可以用于Tisp40在肾间质纤维化中的作用和机制研究：

Tisp40与肾间质纤维化的关系目的：探讨Tisp40在缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)诱导的肾间质纤维化及转化生长因子betal(Transforming growth factor betal,TGF-β1)诱导的TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系中表达量的变化,验证所构建的慢病毒转染Tisp40过表达细胞系TCMK-1/Tisp40效果并在3种所构建的siRNA-Tisp40中筛选沉默效果最好的siRNA-Tisp40。

方法：体内实验C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,免疫组化、RT-PCR及Western blot检测各组小鼠肾脏Tisp40的分布与表达。体外实验采用TGF-β1(10ng/ml)刺激TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系24h建立肾细胞纤维化模型,Western blot检测TGF-β1不同浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)下Tisp40蛋白的表达变化。在野生型TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系(TCMK-1/wildtype,TCMK-1/wt)及Tisp40过表达的TCMK-1/Tisp40细胞中,RT-PCR及Western blot检测Tisp40 mRNA及蛋白表达变化,免疫荧光评估所构建的TCMK-1/Tisp40细胞效果。Western blot检测Tisp40被沉默后的蛋白表达,比较三种siRNA-Tisp40(siRNAl-Tisp40,siRNA2-Tisp40,siRNA3-Tisp40)沉默效率。

结果：体内实验假手术组小鼠(Sham)肾脏Tisp40表达较少;缺血再灌注纤维化组(I/R)中小鼠肾脏Tisp40mRNA及蛋白表达明显增加(p<0.05),Tisp40蛋白主要表达于肾小管。体外实验Tisp40随TGF-β1浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)改变,表达逐渐增多,存在浓度及时间依赖性,在lOng/mlTGF-βi刺激24h后Tisp40表达基本稳定;TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系/wt细胞在TGF-β1刺激前,仅少量表达Tisp40,TCMK-1/wt细胞及TCMK-1/Tisp40细胞经TGF-β1刺激24h后,Tisp40mRNA及蛋白表达明显增多(p<0.05),在TGF-β1刺激前后,TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系/Tisp40细胞的Tisp40表达均高于TCMK-1/wt细胞(p<0.05),Tisp40过表达细胞系TCMK-1/Tisp40构建成功。3种siRNA-Tisp40均可沉默Tisp40,siRNA3-Tisp40沉默效率最高。

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