DMS114人小细胞肺癌细胞的应用与培养操作步骤！

                 DMS114人小细胞肺癌细胞的应用与培养操作步骤！

一、背景

DMS114人小细胞肺癌细胞是一种人小细胞肺癌(SCLC)细胞系，由美国国家癌症研究所(NCI)的模式识别和分类系统实验室(PMCL)开发。该细胞系最初是从一名患有广泛分布的小细胞肺癌的患者身上分离出来的。DMS114细胞可以表达EGF和CR3补体，表达HLA I类和II类抗原。DMS114细胞可以用于3D细胞培养和癌症研究。

DMS114细胞系具有高度增殖能力和快速生长速度的特点，因此在肿瘤研究中被广泛使用。此外，该细胞系还表现出对多种化学治疗药物的敏感性，包括顺铂、依托泊苷、长春新碱等。

由于DMS114细胞系的特殊性质，它被广泛应用于临床前的药物筛选和临床试验中。例如，一些针对小细胞肺癌的新药已经在该细胞系上进行了测试，以评估其疗效和安全性。

二、DMS114人小细胞肺癌细胞复苏、传代、冻存操作

（一）DMS114人小细胞肺癌细胞复苏

①新制100mm平皿1个，含12mL上述培养液；

②冻存管从液氮或-80℃中取出，37℃水浴1~2min,待完全溶解后尽快移入安全柜复苏；

③用无菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，顺时针摇匀；

④放入（37℃，5%CO2）培养箱中，过夜换液，2-4天长满。

注意：建议复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩，避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸造成人员伤害。

（二）DMS114人小细胞肺癌细胞传代

将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入2mL（/100mm皿/T25瓶）胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA），在显微镜下观察，期间禁止摇晃培养皿，细胞刚有脱落时，吸除大部分胰酶，留约0.5mL，移至培养箱消化，约1min取出。传代用6mL培养液终止消化，轻轻吹打均匀细胞，后可1:2传代。

（三）DMS114人小细胞肺癌细胞冻存

冻存则用3mL冻存液（90%FBS+10%DMSO）终止消化，吹打均匀，分为3支冻存管，用程序降温盒于-80℃冻存。

三、应用

DMS114人小细胞肺癌细胞可以用于FGFR1调控FGFR1扩增型肺癌增殖、上皮间质转化和转移的机制研究：

研究FGFR1的激活是否以及怎样促进FGFR1扩增型肺癌的EMT和转移,阐明FGFR1促进FGFR1扩增型肺癌EMT和转移的分子机制,并探究该机制在肺癌FGFR1靶向治疗中的临床意义。

方法：首先,我们分别采用FGFR1的配体成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor2,FGF2)和短干扰RNAs(Short interfering RNAs,siRNAs)在FGFR1扩增型肺癌细胞系中激活和抑制FGFR1,运用CCK8、Western blot、qPCR、划痕实验、Transwell迁移侵袭实验、免疫荧光染色等方法,鉴定细胞增殖、EMT、迁移侵袭等能力是否变化,并探究此过程的分子信号通路。

其次,我们运用MEK/ERK抑制剂AZD6244和持续自主磷酸化突变体ERK2R67S质粒和慢病毒,体内体外研究FGFR1激活后是否通过下游ERK1/2的磷酸化调控Y染色体性别决定区相关HMG盒蛋白2(Sry(Sex determining region of Y chromosome)-related HMG box 2,SOX2)的表达。再次,我们运用慢病毒转染的方法构建SOX2过表达和沉默的稳转细胞株,研究FGFR1是否通过SOX2促进增殖、EMT和转移。

进一步,运用FGFR1扩增型肺癌细胞系、及SOX2过表达的稳转FGFR1扩增型细胞株和免疫缺陷小鼠构建皮下和原位肺癌移植瘤模型,给予FGFR1抑制剂AZD4547,观察体内抑制FGFR1信号通路对肿瘤生长、SOX2表达、EMT和肿瘤转移的影响,以及体内验证SOX2在FGFR1扩增型肺癌的增殖、EMT、转移中的重要作用。最后,我们分析了肺癌患者数据库中FGFR1和SOX2过表达对临床预后的影响。

结果：FGFR1的激活促进FGFR1扩增型肺癌细胞系H1581和DMS114的增殖、EMT和迁移侵袭,而抑制FGFR1可抑制这些过程。FGFR1激活后通过下游ERK1/2的磷酸化上调SOX2的表达,并且持续自主磷酸化突变体ERK2R67S质粒上调SOX2的作用不被FGFR1抑制剂AZD4547或MEK/ERK抑制剂AZD6244抑制。ERK2R67S慢病毒稳转细胞株在体内同样促进SOX2表达。过表达SOX2体内体外均可促进细胞增殖、EMT、迁移侵袭和转移,并且不被FGFR1抑制剂AZD4547抑制;相反,SOX2沉默的稳转细胞株中激活FGFR1不能促进这些过程。重要的是,在SOX2沉默的稳转细胞株中,激活FGFR1不能促进这些过程。在皮下和原位肺癌移植瘤模型中,抑制FGFR1抑制肿瘤生长、SOX2表达、EMT和肿瘤转移。肺癌患者中,高表达FGFR1与高表达SOX2正相关,并均与生存期短相关。

结论：研究新发现了FGFR1的激活通过下游ERK1/2的磷酸化上调SOX2的表达,并在体外和体内证实FGFR1-ERK1/2-SOX2轴促进FGFR1扩增型肺癌的增殖、EMT和转移。该研究对FGFR1靶向治疗具有重要临床意义。

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