小鼠皮下结缔组织细胞的应用及培养操作步骤！

                    小鼠皮下结缔组织细胞的应用及培养操作步骤！

一、背景

小鼠皮下结缔组织细胞由野生型细胞株L中分离得到。对HAT选择培养基敏感，并缺失了腺苷转磷酸核糖基酶与次黄嘌呤转磷酸核糖基酶对8-氮鸟嘌呤(0.003mg/ml)和6-硫代鸟嘌呤(0.1mM)有抗性。

二、小鼠皮下结缔组织细胞培养步骤

1、小鼠皮下结缔组织细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

2、小鼠皮下结缔组织细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）小鼠皮下结缔组织细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠皮下结缔组织细胞可以用于L-WNT3A促进自体骨移植物成骨的作用研究：

实验拟明确自体骨移植物成骨能力的来源以及自体骨移植物离体后保存的时间、温度以及溶液对其成骨能力的影响,进而探究通过调整自体骨移植术中各项影响因素、改善自体骨移植物成骨能力的可行性。本实验有助于开发一种临床治疗方法,改善患者的自体骨移植功效,加速骨修复。

方法：

1、实验动物:Lewis大鼠购自Charles River并用于脊柱融合实验。所有其他实验使用小鼠。为了模拟自体骨移植,将同基因鼠用于骨移植。野生型、β-actin-GFP和Axin2LacZ/+小鼠来自Jackson Labs,Axin2CreERT2/+;R26Rm TmG/+小鼠由来自Jackson Labs的Axin2CreERT2/+和R26RmTm G/+小鼠产生。小鼠骨骼成熟为8-16周龄,老年小鼠为>12月龄。

2、手术方法:SRC骨移植,胫骨单皮质缺损骨移植,颅顶骨移植,上颌无牙嵴缺损骨移植,OVX手术。

3、检测方法:组织学:苯胺蓝,ALP、TRAP活性和五色染色法;免疫组织化学染色;细胞活性检测:TUNEL染色、台盼蓝染色、Caspase3活性;qRT-PCR;内吞作用测定;Wnt活性的测定。

4、统计方法:结果表示为平均值±标准偏差。采用双尾学生t检验和单因素方差分析两种方法用于确定数据之间的显著差异。P值<0.05认为是差异显著,具有统计学意义。

结果：

1、自体骨移植物移植后,存活的细胞富集在矿化基质周围。与骨髓细胞部分相比,骨移植物的矿化基质部分表现出明显的增殖能力和成骨活性。

2、尽管在矿化基质部分和DBM中的骨碎片都是失活的,并且被密集的细胞群包围,但DBM中的Runx2阳性细胞很少,且ALP活性最低,与自体骨移植物相比,其成骨能力较差。

3、Wnt应答细胞主要存在于骨移植物的矿化基质表面,为骨祖细胞。在修复时,这些细胞参与成骨分化的过程,直接促进骨再生,其数量受自体骨移植物的供体年龄影响。

4、随着离体时间的增加,凋亡细胞的数量持续增加,细胞活力下降,而从相同动物获取的相同体积的骨移植物生成的新骨骨量也减少。随着离体时间的增加,Wnt应答细胞群逐渐凋亡。

5、当骨移植物在4℃离体即刻时,细胞坏死处于最低水平。当骨移植物在37℃下离体1小时时,细胞坏死最多。尽管细胞坏死程度存在差异,但在37℃保存1小时的骨移植物产生的新骨量与在23℃保存的骨移植物相同。然而,如果将骨移植物保存在4℃,则比在23℃下保存的骨移植物形成的新骨的量增多。与保存在4℃下的骨移植物相比,保存在23℃和37℃下的骨移植物具有较少的Wnt应答细胞,骨移植物的成骨能力也降低。

6、在4℃生理盐水中保存自体骨移植物可以保持细胞活力,相反,将自体骨移植物保存在37oC生理盐水中会降低细胞活力。无论保存温度如何,在含10%FBS的DMEM溶液中孵育的骨移植物的成骨能力均强于生理盐水中保存的骨移植物。

结论：

1、自体骨移植物中附着于矿化基质的Wnt应答细胞为骨祖细胞,是自体骨移植物成骨能力的来源。

2、在生理温度下,小鼠皮下结缔组织细胞可以极大程度地增强自体骨移植物的细胞活性、增殖能力和成骨潜能,提高自体骨移植物的成骨能力。

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