人结肠腺癌细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                  人结肠腺癌细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

人结肠腺癌细胞是LS 180(ATCC CL 187)结肠腺癌细胞株的胰蛋白酶化变种。它比亲本更易传代，和LS 180一样生成大量的癌胚抗原(CEA)。电镜研究表明有丰富的微丝和细胞质粘液素液泡。直肠抗原3阳性。p53抗原表达阴性，但mRNA表达阳性。与ATCC CL-187来源于同一个肿瘤。LS 174T细胞角蛋白染色阳性。癌基因c-myc,N-myc,H-ras,N-ras,Myb,和fos的表达呈阳性。癌基因k-ras和sis的表达未做检测。

二、人结肠腺癌细胞培养步骤

1、人结肠腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。

2、人结肠腺癌细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）人结肠腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人结肠腺癌细胞可以用于MiR-492调控CD147表达对结肠癌细胞LS174T奧沙利铂耐药性的影响的研究：

研究建立了奥沙利铂耐药结肠癌S174T/L-OHP细胞系,运用该细胞系开展体外实验,可以简化并很好的模拟结肠癌对奥沙利铂耐药的发展。利用此细胞系深入研究耐药的分子机制,可能有助于发展有效治疗方式,将耐药肿瘤细胞逆转为对化疗敏感的细胞。进而发展新型靶向治疗,攻克肿瘤细胞对化疗耐药的问题,这也正是目前结肠癌治疗的一个热点。

研究通过开展体内外细胞生长实验,旨在阐明miR-492/CD 147轴在结肠癌细胞奥沙利铂耐药中的关键功能调控作用。研究结果提示miR-492通过调节CD147,促进结肠癌对奥沙利铂的耐药。CD147可能成为对抗结肠癌奥沙利铂耐药的一个新型治疗靶点。

方法：

1、建立LS174T/L-OHP寸药细胞系本实验所采用的方法是逐步递增培养液中L-OHP浓度、间歇作用于人结肠腺癌细胞,对其进行体外诱导筛选而获得。应用MTT法分别检测倍比稀释浓度的L-OHP对其细胞的抑制率,进而确认所建立细胞系具有良好的耐药性和稳定性。

2、分析Mi R-492/CD147在结肠癌细胞LS174T及耐药细胞LS 174T/L-OHP中的表达实时PCR分析LS 174T/L-OHP和LS174T细胞内miR-492和CD147的mRNA表达水平。Western blot检测LS 174T/L-OHP和人结肠腺癌细胞中CD147的表达水平。揭示miR-492/CD147可能参与人结肠腺癌细胞对奥沙利铂耐药的过程。

3、敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达对LS 174T/LOHP细胞耐药性的影响RNA干扰技术敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达后,MTT实验结果检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性的影响。

4、下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达对CD147蛋白水平的影响。

5、上调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响转染pre-mi R-492外源性上调miR-492,检测LS174T/L-OHP细胞中CD147蛋白含量,双荧光素酶检测CD147 3’-UTR的启动子荧光素酶活性,进而MTT法检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性。

6、体内实验用裸鼠肿瘤耐药细胞,外源性上调miR-492,检测其对CD147的调控作用,同时监测肿瘤体积来揭示miR-492/CD147对肿瘤细胞耐药性的影响。

结果：在本研究中,发现与对照组结肠癌LS174T细胞相比,奥沙利铂耐药细胞LS 174T/L-OHP中miR-492的表达水平较低,CD147的表达水平则更高。在LS 174T-L-OHP中,我们还发现敲低CD147可以增强LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的敏感性。

采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达,CD147表达水平升高；外源性导入pre-miR-492上调miR-492,可以下调CD147的表达水平,同时提高肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。此外,给奥沙利铂耐药移植瘤注入miR-492,能够提高耐药细胞对药物的响应。

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