志贺氏菌属通用PCR试剂盒的操作步骤及研制与应用！

                志贺氏菌属通用PCR试剂盒的操作步骤及研制与应用！

一、背景

志贺氏菌属通用PCR试剂盒是一种用于快速检测志贺氏菌属的生物试剂盒。志贺氏菌属是一类革兰氏阴性细菌，可引起人类细菌性痢疾，是一种常见的肠道传染病。使用PCR试剂盒可以快速、准确地检测出志贺氏菌属，对于感染控制和疾病诊断具有重要意义。

志贺氏菌属通用PCR试剂盒通常由一对特异性引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等成分组成。通过PCR反应，可以特异性地扩增志贺氏菌属的DNA片段，从而对其进行快速检测。使用这种试剂盒的操作过程相对简单，只需将样品DNA加入到PCR反应液中，经过一系列温度变化和反应后，即可得到检测结果。

志贺氏菌属通用PCR试剂盒具有高灵敏度、特异性强、操作简便等优点，适用于临床诊断、食品检测、环境监测等领域。然而，需要注意的是，PCR技术虽然具有高灵敏度和特异性，但也可能受到其他因素的干扰，如DNA提取效率、引物设计等。因此，在使用PCR试剂盒时，需要严格按照操作说明进行，并对结果进行仔细的分析和解释。

二、志贺氏菌属通用PCR试剂盒的操作步骤如下

1、样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2、DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3、PCR反应体系准备：根据试剂盒说明书的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4、PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5、结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在志贺氏菌的感染。

三、应用

志贺氏菌属通用PCR试剂盒可以用于食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用：

食源性致病菌蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、沙门氏(Salmonellaspp)、大肠埃希氏菌0157:H7(E.coli-0157:H7)、志贺氏菌(Shigella spp)、金黄色葡萄球菌(Sta.aureus)、单增李斯特氏杆菌(Listeria monocy togenes)等菌属或菌。通过大量的文献参考和实验,我们经过筛选挑取种或属间特异的序列及相应引物,然后用这些引物对各种细菌的基因组序列进行志贺氏菌属通用PCR试剂盒PCR扩增检测其特异性,最终决定出用于检测的最优的目的基因及沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶Nuc基因、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、、大肠埃希O157:H7的溶血素基因hlyAB、和致病性蜡样芽孢杆菌的溶血素hblA基因设计了6对特异性引物,建立志贺氏菌属通用PCR试剂盒三重PCR,可同时实现对六种食源性致病菌的检测。

试验过程中对志贺氏菌属通用PCR试剂盒多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化,确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序,即优化的三重PCR反应为:50uL反应体系中,dNTP终摩尔量为10pmol,Mg2+75pmol,5U Taq酶,hlyAB、ipaH和hblA终摩尔量分别为5pmol、5pmol和20pmol,invA、hlyA和nuc终摩尔量分别为7.5 pmol、10 pmol和10 pmol,10×PCR反应缓冲液5uL;志贺氏菌属通用PCR试剂盒共同的扩增条件为:预变性(94℃,5 min);28个循环:变性(94℃,30 s),退火(58℃,40 s)延伸(72℃,70 s);延伸:(72℃,12min)。对多重PCR扩增产物构建标准质粒,进行DNA测序,登录Genebank将测序结果进行网上blast,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物,因此该多重PCR反应特异性较强。

本方法志贺氏菌属通用PCR试剂盒对人工污染肉及肉制品,同时检测六种食源性致病菌的灵敏度,O157:H7检出极限为19.8 cfu/mL,志贺氏菌检出极限可达17 cfu/mL,蜡样芽孢杆菌检出极限为17.7cfu/mL。沙门氏菌检出极限为4.7 cfu/mL,单核细胞增生李斯特菌检出极限可达17cfu/mL,金黄色葡萄球菌检出极限为4.5 cfu/mL。

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