NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系的知识与应用！

               NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系的知识与应用！

一、背景

NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系是一种用于研究和治疗小细胞肺癌的细胞系。这种细胞系可以在实验室中培养，以研究肺癌的发病机制、药物作用、肿瘤生长和转移等。

二、NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系培养步骤

1）复苏NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

三、应用

NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于刺五加多糖对人小细胞肺癌H446细胞的抑制作用及免疫调节作用研究：

基于铂类药物的化学疗法已经成为小细胞肺癌(SCLC)患者的标准一线治疗方法。大部分患者在早期化疗中反应良好,但极容易出现耐药性,亦有一部分患者在最初治疗阶段即出现化疗耐药,但目前尚不清楚SCLC中顺铂耐药性发展的机制。所以解决小细胞肺癌的化疗耐药成为SCLC的治疗需要解决的关键问题。

在本研究中,第一部分利用数据库信息分析了来自癌症药物敏感性基因组学小细胞肺癌细胞系(GDSC,N=55)的全外显子测序(WES)数据集和已发表研究的小细胞肺癌的队列(N=101)的WES数据和整体生存率(OS),以寻找顺铂耐药性靶基因和与不良预后相关的基因。结果发现SCLC中的DNAH10突变与原发顺铂耐药性相关(P=0.0350),OS差(HR:3.445;P=0.00035)和较差的无进展生存期(PFS)显著相关(P=0.0142)。随即应用生物信息学分析单样本基因集富集分析(ssGSEA)探索顺铂耐药的潜在信号通路。ssGSEA显示,DNAH10突变与FGFR和FGF的SPRY调控呈负相关关系,与非经典性WNT和AKT/IKK信号通路成正相关关系,并与肿瘤突变负荷(TMB)成正相关。

第二部分,选择多株小细胞肺癌细胞系(分别为DNAH10突变细胞H2066、NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系和野生型细胞H69,H446等),通过RT-PCR、Western blot及CCK8等功能实验,发现NCI-H841人小细胞肺癌贴壁细胞系与DNAH10野生型细胞相比较,DANH10突变细胞中DANH10的mRNA水平及蛋白表达水平均明显升高,进一步通过药物敏感性实验,发现突变型细胞H2066的耐药性明显高于其它DANH10野生型细胞(H69,H446);当使用siRNA敲低H2066细胞中DANH10的表达后,发现敲低DNAH10的H2066细胞的IC50值降低。

第三部分,收集47例小细胞肺癌患者的临床组织样本,行免疫组化发现DNAH10蛋白表达于肿瘤细胞胞浆,而且与DNAH10未突变患者相比较,在突变患者的肿瘤组织中表达增高;同时根据47例患者的临床资料,证实发生突变的患者生存期低于未突变患者,结果具有统计学意义。综上所述,DNAH10突变可能具有预测小细胞肺癌原发化疗耐药性和不良生存的潜在价值。

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