NCI-H526人肺癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

                 NCI-H526人肺癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

一、背景

NCI-H526人肺癌贴壁细胞系是一种常用的体外研究模型，用于研究人类肺癌的生物学特性和药物敏感性。该细胞系源自一名患有非小细胞肺癌的患者，经过多次传代培养而建立起来。

二、NCI-H526人肺癌贴壁细胞系具有以下特点

贴壁生长：该细胞系在培养皿中贴壁生长，形成典型的肿瘤细胞形态。

高增殖率：NCI-H526细胞系具有较高的增殖率，可以在短时间内达到较高的细胞密度。

EGFR突变：该细胞系中存在EGFR基因的突变，这使得它对一些针对EGFR的药物具有敏感性。

对化疗药物敏感：NCI-H526细胞系对多种化疗药物具有敏感性，包括紫杉醇、顺铂等。

三、NCI-H526人肺癌贴壁细胞系培养操作

1) 复苏NCI-H526人肺癌贴壁细胞系将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H526人肺癌贴壁细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)NCI-H526人肺癌贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

NCI-H526人肺癌贴壁细胞系可以用于RNA干扰抑制人肺癌细胞HMGB1基因表达的实验研究：

研究在人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、NCI-H526人肺癌贴壁细胞系、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446中筛选高表达HMGB1的细胞株，作为人肺癌细胞HMGB1基因研究的理想材料，为下一步进行的RNAi实验研究的细胞模型的选择奠定了基础；

设计针对HMGB1为靶点的siRNA，观察通过RNA干扰抑制HMGB1基因表达后，高表达HMGB1的人肺癌细胞株L9981增殖和侵袭能力的改变，体外验证HMGB1基因做为治疗靶点的可行性；

为临床开发应用和探索肿瘤治疗的新途径提供实验和理论基础；应用RNA干扰联合基因芯片技术检测HMGB1表达下调后肺癌细胞基因表达谱的差异情况，筛选与HMGB1相互作用的基因及可能的信号通路，探讨HMGB1基因在肺癌中的作用机制。

方法：

1、常规培养人肺鳞癌细胞株YTMLC-9、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株L9981及人小细胞癌细胞株NCI-H446，采用实时荧光定量PCR和Westernblot方法对人肺癌细胞HMGB1基因在4株细胞中的mRNA和蛋白水平的表达进行检测，筛选出高表达HMGB1基因的人肺癌细胞株。

2、根据siRNA设计原则，设计合成靶向HMGB1基因的siRNA，采用阳离子脂质体试剂瞬时转染已经筛选出的高表达HMGB1的人大细胞肺癌细胞株L9981，利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后HMGB1基因的沉默效果，评价siRNA设计的合理性及RNA干扰抑制HMGB1表达的有效性；确定RNA干扰抑制HMGB1表达确实有效后，培养人大细胞肺癌细胞株L9981，分为3组进行RNA干扰研究，分别为转染靶向HMGB1基因的siRNA组，转染无关序列组和空白对照组，于RNA干扰后48小时，用细胞活力计数仪测定3组细胞活力；分别在RNA干扰后24、48、72和96小时应用MTT实验检测3组细胞生存状态，计算生长抑制率并绘制生长曲线；应用boyden chamber法检测3组侵袭能力的差异。

3、采用阳离子脂质体试剂向人肺癌细胞L9981转染靶向HMGB1基因的siRNA，下调HMGB1的表达。应用Affymetrix HU133 plus 2基因芯片检测人肺癌细胞L9981 HMGB1基因表达下调后，全基因表达谱的变化，并应用GCOS(Gene-ChipOperation Software)软件分析筛查数据，对相关基因和信号通路进行综合分析。

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