小鼠视网膜神经节细胞株的应用及培养操作步骤！

                  小鼠视网膜神经节细胞株的应用及培养操作步骤！

一、背景

小鼠视网膜神经节细胞株是一种来源于小鼠视网膜神经节细胞的细胞系。这些细胞具有神经元的特征，可以用于研究视觉信号传导、神经退行性疾病等方面的生物学和医学研究。

小鼠视网膜神经节细胞株可以通过体外培养获得，常用的培养方法包括贴壁法和悬浮法。贴壁法是将小鼠视网膜神经节细胞接种在含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的生长和分化，形成单层贴壁的神经元。悬浮法是将小鼠视网膜神经节细胞悬浮在含有特定培养基的培养瓶中，通过离心等方法分离出神经元进行培养。

小鼠视网膜神经节细胞株在研究中具有广泛的应用价值，例如可以用于研究视觉信号传导的机制、神经退行性疾病的发生和发展等。此外，还可以用于药物筛选和毒性评价等领域的研究。

二、小鼠视网膜神经节细胞株培养操作

1)复苏小鼠视网膜神经节细胞株：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠视网膜神经节细胞株传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠视网膜神经节细胞株冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠视网膜神经节细胞株可以用于TGFβ信号通路在小鼠视网膜神经节细胞轴突再生过程中作用的实验研究：

以小鼠视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)为研究对象,观察转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)信号传导通路在小鼠RGCs轴突再生过程中的作用。

本实验应用木瓜蛋白酶消化法、免疫磁珠筛选等方法成功分离获得小鼠RGCs,Brn3b免疫细胞荧光化学染色对其进行鉴定,应用Calcein AM及Hoechst对细胞进行免疫细胞荧光化学染色,从而在12个蛋白激酶抑制剂中成功筛选出促小鼠RGCs存活及其神经突再生的4个候选激酶抑制剂即TGFβ?型受体激酶抑制剂(TGFβReceptor Inhibibitor,TGFβRI)(AL 47070)、P38MAP激酶抑制剂(AL 42243、AL 42245、AL 46144),其中作用最明显的为TGFβ?型受体的抑制剂(AL 47070);

应用Realtime PCR检测TGFβ下游靶基因IGF1、NRP2、IL6,发现AL 47070作用组与对照组相比较IGF1、NRP2、IL6表达明显下降,说明AL 47070从mRNA水平阻断了TGFβ信号传导通路;应用Western-blot方法检测TGFβRI(AL 47070)作用小鼠RGCs后,总Smad2、P-smad2、总Smad3、P-smad3的表达,发现总Smad2、Smad3并未有明显变化,而P-smad2、P-smad3明显下降,说明从蛋白水平证明TGFβRI(AL 47070)阻断了小鼠RGCs的TGFβ信号传导;应用MAP2b和Tau免疫细胞荧光化学染色,发现TGFβR(IAL 47070)作用小鼠RGCs后即有MAP2b和Tau双阳性的神经突还有MAP2b染色阳性而Tau染色阴性的神经突,证明在体外细胞培养模式下,阻断TGFβ信号传导通路可以促进小鼠RGCs树突及其轴突再生;

应用Calcein AM及Hoechst免疫细胞荧光化学染色成功的证明在细胞培养条件及视网膜组织块培养条件下,TGFβRI(AL 47070)比已知的对轴突再生有促进作用的神经营养因子如BDNF、CNTF、GDNF强;

此外,建立小鼠视神经夹伤模型,应用甲苯胺蓝尼氏小体染色发现手术组比未手术组细胞明显减少,证明我们模型建立成功,应用GAP-43免疫组织荧光化学对视神经进行染色,证明在视神经损伤的情况下,阻断TGFβ信号传导可以促进小鼠RGCs轴突再生。

综上所述,本实验成功的分离培养小鼠RGCs,分别在体外、体内实验发现阻断TGFβ信号传导能路可以促进小鼠RGCs的轴突再生。为治疗青光眼等视网膜神经节细胞损伤疾病提供了新的实验基础,期望能为治疗青光眼等疾病提供新思路及手段。

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