大鼠脾淋巴细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                    大鼠脾淋巴细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

大鼠脾淋巴细胞是一种来源于大鼠脾脏的淋巴细胞系。这些细胞具有免疫细胞的特征，可以用于研究免疫学、肿瘤学、传染病学等领域。

大鼠脾淋巴细胞可以通过体外培养获得，常用的培养方法包括贴壁法和悬浮法。贴壁法是将大鼠脾淋巴细胞接种在含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的生长和分化，形成单层贴壁的淋巴细胞。悬浮法是将大鼠脾淋巴细胞悬浮在含有特定培养基的培养瓶中，通过离心等方法分离出淋巴细胞进行培养。

大鼠脾淋巴细胞在研究中具有广泛的应用价值，例如可以用于研究免疫应答的机制、肿瘤免疫治疗、病原体感染的免疫应答等。此外，还可以用于药物筛选和毒性评价等领域的研究。

二、大鼠脾淋巴细胞培养操作

1)复苏大鼠脾淋巴细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠脾淋巴细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠脾淋巴细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

大鼠脾淋巴细胞可以用于IRE1/XBP1对重症急性胰腺炎大鼠脾淋巴细胞凋亡的作用研究：

探讨IRE1/XBP1对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠脾淋巴细胞凋亡的作用。

方法：30只SPF级别的成年雄性SD实验大鼠,随机分成假手术组(Sham-operated group,SO组)、SAP 6h组及SAP 12h组,每组各10只。5%牛磺胆酸钠溶液胰胆管逆行注射构建SAP实验动物模型,SO组大鼠只是翻动胰腺后随即关腹做实验对照组。

SO组大鼠于术后12h取材,SAP组大鼠分别于术后6h、12h取材,利用紫外分光光度计测定所有实验大鼠血清淀粉酶及脂肪酶含量,大鼠胰腺组织采用HE染色观察病理严重程并进行病理评分,流式细胞术检测脾淋巴细胞凋亡率,透射电镜观察脾淋巴细胞凋亡形态,RT-q PCR、Western blot法检测大鼠脾淋巴细胞IRE1、XBP1、凋亡相关基因Bax及Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平。

结果：(1)与SO组相比,SAP组脾淋巴细胞凋亡率明显增高,在6h达到高峰,12h时稍下降,但仍高于SO组,差异有统计学意义(P<0.05)。

(2)SO组大鼠脾淋巴细胞IRE1、XBP1 mRNA及蛋白呈低表达;与SO组比,SAP组大鼠脾淋巴细胞IRE1、XBP1表达水平升高,SAP 12h组升高更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。

(3)SO组大鼠脾淋巴细胞Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白呈低表达,与SO组比,SAP组大鼠脾淋巴细胞Bax、Caspase-3的表达水平明显升高,在6h时达到高峰,12h稍下降,但仍高于SO组,差异有统计学意义(P<0.05)。

(4)SAP 6h组、12h组大鼠脾淋巴细胞IRE1、XBP1蛋白表达水平与Bax、Caspase-3蛋白表达水平呈正相关(均P<0.05),随着IRE1和XBP1表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平随之升高。

(5)SAP6h组、12h组大鼠脾淋巴细胞IRE1、XBP1蛋白表达水平与淋巴细胞的凋亡呈正相关(均P<0.05),随着IRE1和XBP1表达水平升高,淋巴细胞凋率增高。

结论：SAP大鼠脾淋巴细胞IRE1/XBP1表达水平明显升高,淋巴细胞凋亡增多;IRE1/XBP1高表达引起Bax和Caspase-3的表达水平升高,可能是导致SAP大鼠脾淋巴细胞凋亡增多的重要原因。

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