A101D 人黑色素瘤贴壁细胞系的特点与应用！

                   A101D 人黑色素瘤贴壁细胞系的特点与应用！

一、背景

A101D人黑色素瘤贴壁细胞系是一种来源于人类黑色素瘤的贴壁细胞系。这种细胞系是通过将人类黑色素瘤组织移植到裸鼠体内，然后从移植瘤中分离出的一种细胞系。

二、A101D人黑色素瘤贴壁细胞系具有以下特点

贴壁生长：该细胞系在培养基上能够贴壁生长，形成单层或多层的细胞集落。

高增殖能力：该细胞系具有较高的增殖能力，可以在短时间内快速扩增。

表达多种肿瘤相关基因：该细胞系表达多种与黑色素瘤相关的基因，如MITF、TYR、MC1R等。

对药物敏感性较高：该细胞系对某些化疗药物和靶向药物具有较高的敏感性，可以用于药物筛选和治疗策略的研究。

三、A101D人黑色素瘤贴壁细胞系培养步骤

1）复苏A101D人黑色素瘤贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）A101D人黑色素瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）A101D人黑色素瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

四、应用

A101D人黑色素瘤贴壁细胞系可以用于光动力治疗对黑色素瘤细胞侵袭、增殖能力的影响及其机制研究：

以小鼠黑色素瘤细胞B16-F10和A101D人黑色素瘤贴壁细胞系进行研究,研究5-ALA-PDT对黑色素瘤细胞系迁移和侵袭能力的影响及其机制,同时也探查了光敏剂5-ALA促进PDT从而影响黑色素瘤细胞的增殖的相关机制,为光动力治疗黑色素瘤提供理论依据和数据支持。

ALA-PDT抑制A101D人黑色素瘤贴壁细胞系和B16-F10(鼠)迁移和侵袭及其机制研究：1、ALA-PDT抑制黑色素瘤细胞A375和B16-F10体外迁移和侵袭能力:利用细胞划痕实验检测黑色素瘤细胞迁移能力时发现,2.4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A101D人黑色素瘤贴壁细胞系12h及24h后的迁移率相比较空白对照组明显降低(p<0.001)。

同时利用Transwell小室实验检测黑色素瘤细胞侵袭能力,

结果显示：2.4J、4.8J ALA-PDT处理24h后,B16-F10和A101D人黑色素瘤贴壁细胞系通过Matrigel基质胶的细胞数量少于空白对照组A375细胞侵袭数目(p<0.001)。2.ALA-PDT处理后,A375、B16-F10自分泌炎症因子mRNA的下调:

2、4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A375细胞12h及24h后对两种细胞自分泌炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-βm RNA水平进行染料q-PCR检测,发现在光动力治疗能量及时间对两种细胞系炎症因子分泌的影响都呈现一定剂量依赖的关系,但仅TGF-βm RNA水平在两株细胞内均有不同程度下调(P<0.05)。

ALA-PDT处理后,A375、B16-F10自分泌炎症因子蛋白的下调:2.4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A375细胞12h及24h后对A375、B16-F10自分泌炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β蛋白水平进行ELISA检测,与mRNA定量检测结果一致,光动力治疗能量及时间对两种细胞分泌到胞外炎症因子的水平的影响同样呈现一定剂量依赖的关系,仅TGF-β有不同程度下调(P<0.05)。

外源性添加TGF-β逆转了PDT对A375、B16-F10迁移和侵袭的能力的抑制:回补10ng/ml TGF-β进行反向验证,分组为:空白对照组、TGF-β组、4.8J PDT组,4.8J PDT+TGF-β组,使用细胞划痕实验检测,结果发现回补TGF-β逆转PDT对A375、B16-F10迁移能力的抑制(P<0.05);使用Transwell小室检测,结果发现回补TGF-β逆转PDT对A375、B16-F10细胞侵袭能力的抑制(P<0.05)。

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