人神经母细胞瘤细胞的培养操作步骤及应用研究！

                人神经母细胞瘤细胞的培养操作步骤及应用研究！

一、背景

人神经母细胞瘤细胞是一种人神经母细胞瘤细胞系。这种细胞通常用于研究和了解神经母细胞瘤的生物学特征，以及探索相关的治疗策略。

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，通常起源于交感神经系统的任意神经脊部位。SH-SY5Y细胞是在神经母细胞瘤的背景下分离出来的，因此，它们可以作为这种疾病模型的一部分，用于研究和理解疾病的病因、进程和响应治疗方案。

二、人神经母细胞瘤细胞培养步骤

1、人神经母细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）人神经母细胞瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、人神经母细胞瘤细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人神经母细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人神经母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

三、应用

人神经母细胞瘤细胞可以用于核蛋白PCNP对人神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响：

探讨PCNP基因过表达及沉默对人NB细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤的影响,并寻找可能导致这些变化的机制。

方法：将PCNP过表达及干扰质粒转染人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH,并分别采用G418和嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株,将得到的稳定株采用MTS、EDU法检测细胞增殖;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡水平变化;采用划痕、transwell、invasion、soft agar实验检测细胞迁移和侵袭能力;并通过蛋白免疫印迹法Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR通路相关分子表达的变化;将PCNP过表达及沉默的人NB细胞注射入裸鼠腋下检测PCNP对人NB细胞成瘤能力的影响。

结果：(1)成功构建PCNP过表达及沉默稳定株;

(2)MTS、EDU检测SH-SY5Y细胞和SK-N-SH细胞增殖情况,结果显示PCNP过表达抑制细胞增殖,沉默促进细胞增殖;

(3)Tunel染色法检测细胞凋亡,结果显示PCNP过表达促进NB细胞凋亡,沉默抑制凋亡;

(4)划痕和transwell法检测PCNP对NB细胞迁移能力的影响,结果表明PCNP过表达后细胞迁移能力减弱,沉默后增强;

(5)invasion和soft agar实验检测细胞侵袭能力,结果表明PCNP过表达减弱NB细胞侵袭能力,而PCNP沉默侵袭增强;

(6)Western blot结果显示PCNP过表达后Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase8、Cleaved Caspase9表达增多,而PCNP沉默后表达减少;PCNP过表达导致SH-SY5Y细胞bax表达增多,bcl-2表达减少;相反PCNP沉默导致细胞bax表达减少,bcl-2表达增加,与凋亡实验结果一致;因此PCNP可能通过调控细胞凋亡而影响生长;

(7)Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关分子表达的变化,结果显示PCNP过表达后p-JNK、p-P38和p-Erk表达增多,而磷酸化的PI3K、AKT、mTOR与对照相比表达减少;而PCNP沉默后磷酸化的JNK、P38和Erk表达减少,磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表达增多,因此PCNP可能通过MAPK信号转导通路调控NB细胞凋亡,通过PI3K/AKT/mTOR通路调控NB增殖;

(8)注射PCNP过表达细胞的裸鼠腋下肿瘤较对照组减小,注射PCNP沉默细胞的裸鼠腋下形成的肿瘤较对照组增大。

结论：1、PCNP抑制人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH增殖;

2、PCNP促进人NB细胞凋亡;

3、PCNP抑制人NB细胞迁移和侵袭;

4、PCNP可能通过MAPK信号转导通路和PI3K/AKT/mTOR通路调控细胞凋亡及增殖;

5、PCNP抑制人NB细胞移植瘤形成。

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