人白血病细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                     人白血病细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

人白血病细胞是一种起始于血液形成组织的癌症。白血病细胞是一种异常的白细胞，它不会在应该死亡的时候死亡，反而会过度增殖，影响正常的血细胞，如白细胞、红细胞和血小板。白血病主要分为急性白血病和慢性白血病两大类，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性粒细胞性白血病（AML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）以及慢性粒细胞白血病（CML）等。

人白血病细胞（NOMO-1 Cell）是从一名25岁的白人男性肺腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞具有淋巴母细胞样的形态特征，并且能够在体外培养中表现出悬浮生长的特点。在科学研究领域，NOMO-1 Cell被广泛应用于白血病的研究、药物筛选和毒性测试等方面。

二、人白血病细胞培养步骤

1、人白血病细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）人白血病细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、人白血病细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NOMO-1人白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人白血病细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

三、应用

人白血病细胞可以用于Venetoclax联合地塞米松对急性髓系白血病细胞的作用及初步机制研究：

探索BCL-2抑制剂Venetoclax联合地塞米松在体外对急性髓系白血病(AML)细胞的抗肿瘤作用,以及减弱骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对AML细胞系的保护作用及其潜在的调控机制。

方法：Venetoclax和地塞米松单独或联合处理AML细胞系MOLM-13、NOMO1和THP-1,实验分组:未加药的对照组、Venetoclax单药组、地塞米松单药组、Venetoclax和地塞米松联合组;通过CCK-8检测AML细胞的活力;通过Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测其凋亡;通过Western blot(WB)检测凋亡相关蛋白PARP,BCL-2家族蛋白BCL-2、MCL-1和BCL-XL等蛋白的表达水平;qRT-PCR验证BCL-2家族BCL-2、MCL-1和BCL-XL等基因的表达;使用Mitotracker Deep Red试剂对MSCs的线粒体进行染色,然后将其与AML细胞共培养,Venetoclax与地塞米松单独或联合作用于共培养体系,实验分组同上,通过流式细胞术检测AML细胞的凋亡、线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS)水平和线粒体荧光信号。

结果：地塞米松对AML细胞活力和凋亡没有显著影响。相对于Venetoclax单药处理,地塞米松与Venetoclax联合后,会增强Venetoclax的降低AML细胞活力的作用,引起更多的AML细胞凋亡。WB结果表明,与对照组相比,地塞米松单独使用会增加AML细胞中MCL-1蛋白的表达,地塞米松与Venetoclax联合作用,也增加了AML细胞中MCL-1蛋白的表达。AML细胞与MSCs共培养后,MSCs的存在减少了Venetoclax诱导的AML细胞凋亡,地塞米松联合Venetoclax仍会增加Venetoclax诱导的凋亡。

共培养时,Venetoclax会增加AML细胞中的ROS水平和MSCs向AML细胞转移的线粒体,地塞米松会降低AML细胞中的ROS水平和MSCs向AML细胞转移的线粒体,地塞米松联合Venetoclax会降低AML细胞中Venetoclax诱导的ROS水平,使MSCs向AML细胞转移的线粒体减少,这可能会导致MSCs对AML细胞的保护作用减弱。

结论：地塞米松增强了Venetoclax在体外的抗肿瘤效果,Venetoclax联合地塞米松会减少AML细胞中Venetoclax诱导的ROS水平,并减少MSCs向AML细胞转移的线粒体,这可能导致减弱MSCs对AML细胞的保护作用。

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