OCM-1A人脉络膜黑色素瘤细胞的培养操作规程！

                    OCM-1A人脉络膜黑色素瘤细胞的培养操作规程！

一、背景

OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞具有高度增殖能力和侵袭性，能够迅速扩散到周围组织和远处器官。因此，它被广泛用于评估抗肿瘤药物的疗效和毒性，以及开发新型的抗肿瘤治疗方法。此外，OCM-1A细胞系也被用于研究肿瘤发生和发展的机制，以及探索新的靶点和治疗方法。

二、OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

OCM-1A细胞系|人脉络膜黑色素瘤细胞可以用于miR-200c/Zeb1负反馈回路对眼内肿瘤上皮间质转化及成瘤性的作用：

研究microRNA-200c与Zeb1构成的双向负反馈调节通道对眼内恶性肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)、成瘤能力及迁徙转移能力的调控作用。

方法：1)miR-200c对眼内肿瘤上皮间质转化及迁徙能力的调控。①建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。应用miR-200c的模拟物和抑制剂对人眼脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1、人视网膜母细胞瘤细胞株WERI-RB1和Y79进行瞬时转染,在三个细胞株中建立miR-200c过表达及表达抑制的细胞模型。通过对miR-2O0c载体所携带的FAM荧光对转染后的细胞内的荧光表达情况进行荧光显微镜下的肉眼观察,初步评估转染效率。应用实时定量PCR对转染前后各株细胞中miR-200c的表达水平进行检测进一步评估转染效率。

②miR-200c对其靶基因——上皮间质转化过程的重要转录因子Zeb1的调节作用。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法对OCM-1、WERI-RB1和Y79细胞miR-200c转染前后细胞内的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表达进行检测,以验证miR-200c在眼内肿瘤对Zebl的调控作用。

③miR-200c对眼内肿瘤细胞上皮-间质转化的调控。使用实时定量PCR、免疫印迹法及免疫荧光等分子生物学检测方法,对三个细胞株miR-200c转染前后细胞内上皮标记因子E-cadherin、间质标记因子Vimentin和N-cadherin分别进行不同表达水平的定性、定量和定位,以检验miR-200c对上皮-间质转化因子的调控作用。

④miR-200c对眼内肿瘤细胞体外迁徙能力的调控。利用Transwell小室对OCM-1和Y79细胞各组(未转染组、空白对照转染组、模拟物WERI-RB1转染组、抑制剂转染组)进行体外透膜迁徙能力检测,以评估的表达干扰对眼内肿瘤细胞运动能力的作用。

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