5637人膀胱癌细胞的应用与培养操作及研究动态！

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一、背景

5637人膀胱癌细胞来自一名68岁男性白人的膀胱癌组织，现常用于泌尿系统疾病的发病机理研究。5637贴壁生长，显微镜下呈上皮细胞样，能生成SCF、IL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF等。该细胞经本库STR鉴定结果无误，且支原体检测阴性。

5637人膀胱癌细胞推荐使用RPMI1640培养基，含10%胎牛血清，在37度、5%CO2培养箱中培养。5637建议每周2-3次更换新鲜培养基，按1:3至1:4进行传代，37度胰酶消化3-4分钟，传代周期通常为2-3天。特别注意的是，该细胞相对较难消化，需要延长消化时间，消化到细胞收缩变圆，轻拍培养瓶侧边，细胞可以滑落方可终止消化。

二、5637人膀胱癌细胞培养操作

1)复苏5637人膀胱癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)5637人膀胱癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)5637人膀胱癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

5637人膀胱癌细胞可以用于SPTBN2基因在膀胱癌中的表达及对膀胱癌5637细胞增殖、迁移和侵袭的影响：

研究非红细胞血影蛋白β2(Spectrin Beta,Non-Erythrocytic 2,SPTBN2)在膀胱癌组织中的表达,与临床病理因素的相关性,以及对膀胱癌5637细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

方法：

(1)通过TCGA数据库和GSE13507数据集,分析SPTBN2在膀胱癌中的表达情况,以及与患者预后和临床病理因素的相关性。

(2)通过单基因GSEA分析和蛋白互作分析,研究SPTBN2可能涉及的信号通路和生物学功能。

(3)采用RNA干扰技术(RNA interfering,RNAi)沉默膀胱癌5637细胞中SPTBN2的表达,实验分为空白对照组(blank control group,Blank组)、阴性对照组(negative control group,NC组)、siRNA#1实验组和siRNA#2实验组。实验组转染靶向SPTBN2 siRNA,NC组转染通用阴性siRNA,空白对照组加入等量转染试剂。实时荧光定量PCR检测细胞中SPTBN2基因的表达水平,Western blot检测细胞内SPTBN2蛋白的表达量。CCK-8法检测膀胱癌5637细胞增殖情况。划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力。

结果：

(1)本研究基于对TCGA膀胱癌数据集和GSE13507数据集的分析发现SPTBN2在膀胱癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织,高表达SPTBN2的患者预后较低表达SPTBN2患者差,差异具有统计学意义(P<0.05)。SPTBN2在膀胱癌中的表达量与T分期(OR=2.152,95%CI=1.390-3.364,P<0.001)、N分期(OR=1.935,95%CI=1.257-2.999,P=0.003)和组织学类型(OR=10.313,95%CI=2.941-65.289,P=0.002)存在相关性。

(2)单基因GSEA富集分析显示,SPTBN2相关差异基因主要富集在KRAS信号通路。KEGG富集分析显示,SPTBN2相关互作蛋白主要富集于细胞凋亡、肿瘤蛋白多糖、线粒体自噬、缝隙连接、膀胱癌信号通路。GO富集分析显示,SPTBN2相关互作蛋白在分子功能分类中主要富集于细胞骨架结构形成、血影蛋白结合、离子通道结合。在细胞组分分类中主要富集于轴突始段、轴突主干、轴突部分。在生物过程分类中,富集于轴突导向、神经元投射引导、膜电位调节。SPTBN2与MAPK信号通路相关基因KRAS(r=0.338,P<0.001)、RAF1(r=0.362,P<0.001)、MAP2K1(r=0.338,P<0.001)、MAPK1(r=0.382,P<0.001)、EGFR(r=0.360,P<0.001)具有相关性,差异具有统计学意义。

(3)转染SPTBN2 siRNA后,实验组的SPTBN2转录水平和SPTBN2蛋白表达量均低于阴性对照组和空白对照组。实验组的增殖、迁移和侵袭能力较阴性对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：

(1)SPTBN2在膀胱癌中的表达量增加,与膀胱癌发展相关,高表达SPTBN2的膀胱癌患者预后较差。

(2)沉默SPTBN2能够抑制膀胱癌5637细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

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