人B淋巴细胞瘤细胞的培养操作规程及活性鉴定！

                   人B淋巴细胞瘤细胞的培养操作规程及活性鉴定！

一、背景

人B淋巴细胞瘤细胞该细胞来源于一位3岁的白人Burkitt淋巴瘤患者；EBV阴性；表达IL-4受体和低亲和性IgE受体（CD23）；每个细胞表面大约有1500个IL-4的结合位点；分泌IgM（lamdaL）；表达膜型和分泌型的免疫球蛋白。

B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型众多，经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤（MCL）5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，占非霍奇金淋巴瘤的3/4。B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。

二、人B淋巴细胞瘤细胞培养操作规程

1、人B淋巴细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基（RPMI-1640，GIBCO）；北美胎牛血清（灭活），10%；双抗1%。

2）人B淋巴细胞瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）人B淋巴细胞瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、人B淋巴细胞瘤细胞处理：

1）复苏人B淋巴细胞瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人B淋巴细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM，常温条件下离心5分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，吹打均匀后，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。

三、应用

人B淋巴细胞瘤细胞可以用于EBV体外转染人B淋巴细胞方法的优化及B淋巴母细胞样细胞系的体外建立：

探讨CpG基序和CD40激发型抗体(5C11)对EBV转化的作用,从而优化B-LCLs建系的方法,对于体外利用和研究B淋巴细胞株具有重要的理论价值和潜在的运用意义。

1、EBV体外转染人B细胞方法的优化

探讨体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)的优化方法及其影响因素。

方法：用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CD40激发型抗体(5C11)、CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19的表达水平。

结果：PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B淋巴母细胞系。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体(5C11)及CpG免疫调节基序联合运用,明显地提高了EBV转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。

结论：CD40信号激发和CpG免疫调节基序联合运用有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。

2、人B淋巴母细胞系的体外建立及生物学活性鉴定

体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)并鉴定其生物学活性。

方法：光学显微镜下观察,并做Giemsa染色,观察LCLs的形态特征;提取LCLs的总RNA,检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1的存在;利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19、CD40的表达水平。

结果：PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B淋巴母细胞系。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。转化后的LCLs含有LMP1基因,并保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。

结论：用EBV体外转染方法成功建立B淋巴母细胞样细胞系,转化后的B淋巴母细胞能持续分裂,并保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！