蛭弧菌的分布和分离及应用价值与应用中存在的问题！

                蛭弧菌的分布和分离及应用价值与应用中存在的问题！

一、菌种简介

蛭弧菌是寄生于其他细菌（也可无寄主而生存）并能导致其裂解的一类细菌。它虽然比通常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用，但它不是病毒，确确实实是一类能"吃掉"细菌的细菌。

二、形态特征

蛭弧菌有细菌的一切形态特征，单细胞，弧形或逗点状，有时呈螺旋状。革兰氏染色阴性。大小为0.3~0.6 pmX0.8~1.2μm。一般端生单鞭毛，有的在另一端生有一束纤毛。水生蛭弧菌的鞭毛还具有鞘膜，它是细胞壁的延伸物，并包围着鞭毛，使得它比其他细菌的鞭毛粗3~4倍，这是一个很显著的特点.细胞中蛋白质含量较高，占干重的60%~70%。DNA含量为5%，G+C含量为42~51mol%。有人认为，蛭弧菌DNA的80%来源于宿主细胞的DNA。

三、侵入对象

蛭弧菌与宿主细胞之间，常表现出一定的特异性。不过，有的特异性较差，能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各类不同的植物病原菌。

蛭弧菌在人的某些病原菌体中也已发现，藻类和某些农业致病真菌细胞中亦有它分布。这些蛭弧菌的溶菌作用，对于控制农业及人畜病原微生物，无疑是有价值的。虽然蛭弧菌可使一些细菌遭受毁灭性裂解，然而，它本身的命运同样遭受到另一类小生物的威胁。1970年首次发现了蛭弧菌噬菌体(bdellophage) ，它们对寄生或非寄生两种类型的蛭弧菌均有裂解作用。不过，专一性严格，只对一定的种株作用，并有自己的裂解过程。

当蛭弧菌直接附着于宿主细胞之前，或者在完成侵入宿主细胞周质以前，蛭弧菌噬菌体的尾部首先附着在蛭弧菌细胞上，然后该噬菌体将核酸注入蛭弧菌菌体中，于是完成了它的入侵过程，而噬菌体头部，完全以空壳保留在蛭弧菌细胞之外，被感染了噬菌体的蛭弧菌，其形态、大小不变，噬菌体却在细胞内大量复制。与此同时，蛭弧菌本身仍在宿主细菌的周质中，以二均分裂的方式繁殖，其结果，蛭弧菌的宿主细胞裂解，蛭弧菌噬菌体的子代也随之被释放出来。至于噬菌体如何通过蛭弧菌宿主释放于体外，实质性的机制还不清楚。

实验证明：在宿主细菌-蛭弧菌-蛭弧菌噬菌体之间，已构成了一种独特的"三位一体"的寄生系统。它们之间的相互作用，或许发生在自然生态系统之中，也可能是另一种情况，即蛭弧菌噬菌体的天然宿主是非寄生型蛭弧菌，或者以溶源状态天然存在，通过某种诱导因子的作用而得到发展。如果真是这样，无疑对其宿主是个威胁。

四、分布和分离

蛭弧菌广泛存在于自然界，土壤、河水、附近海洋水域及下水道污水中都有分布，干净的井水、泉水中找不到它们的存在。一般污水中含菌数105个/毫升，下水道污水中可含菌数万个/毫升，土壤中含菌数103-5个/克。怎样检查和分离蛭弧菌呢?多少需要借鉴细菌病毒研究中所使用的方法。即将蛭弧菌与敏感菌混合倒平板，在适宜条件下培养2-3天，平板上便会出现类似噬菌体的噬菌斑，并逐渐扩大，宿主细胞完全被溶解而形成透明区。从这些透明区中就可分离到蛭弧菌。利用这一特征，还可计算出蛭弧菌噬菌体的数目。同时可追踪增殖过程、寄生潜伏时间、新产生蛭弧菌的数量以及它们的活性等。例如蛭弧菌噬菌体杀死宿主细胞而不产生噬菌斑，遇到这种情部，用此法就较困难。如果要从土壤中分离蛭弧菌，应将少量样品先制成悬浮液，经滤膜过滤，以截留大的细菌，让小的蛭弧菌通过，取滤液进行分离。

蛭弧菌不仅宿主范围广泛，加之特殊的生活方式，使之具有生态学优势。其一，蛭弧菌进入到其他细菌的周质空间，可以确保营养需要，不依赖外界的来源。因此，即使在营养物质很少的地方，诸如海洋、江河、湖泊等生态系统中也能生长；其二，周质内的环境是一个无竞争的小生境。这对生长缓慢的蛭弧菌无疑是个很有利的条件；另外，周质空间被一个稳定的、坚强的细胞壁所包围，有似大分子不能通过，即使小分子也不易透过，这就为蛭弧菌提供了一个保护性环境。

五、应用价值

1、防治有害细菌

由于上述特性，使蛭弧菌具有很大的潜在应用价值，很可能成为生物防治有害细菌的一种有力武器，首先，它有可能用于净化水体和清除工、农、医等方面的有害细菌。在农业上，有人将水生蛭弧菌跟引起水稻白叶枯病的黄杆菌混合在一起，加入农田灌溉水中，由于蛭弧菌以黄杆菌为"食料"，使灌溉水中该致病菌大大减少。对大豆痘病、柑桔溃疡病、棉花凋萎病的致病菌也具较强的侵染力，因而它可能成为人类与农业致病进行斗争的有力武器。在医学上，有的蛭弧菌对伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌等人畜致病菌也有很强的裂解作用。例如，有人用蛭弧菌有效地防治了由弗氏志贺氏菌引起的兔角质结膜炎和肠道疾病。蛭弧菌的防治作用，或者防止感染，或者明显地减少疾病的持续时间和严重程度。当用蛭弧菌和志贺氏菌混合接种时，在肠中的志贺氏菌的数量大幅度减少。然而，给动物强行喂养蛭弧菌则未获得成功效果；第二，这类细菌大量存在于污水中，对大肠杆菌和沙门氏菌属的细菌均有广泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作为水域污染程度的一项最终指标(一般是以大肠杆菌的含菌数/毫升作为水源污染的指标)。

值得注意的是：它对一些有益的细菌如固氮菌等亦有裂解作用。在理论研究中，蛭弧菌同样具有十分重要的意义。特别是宿主细菌-蛭弧菌-蛭弧菌噬菌体这个"三位一体"的寄生系统，更引人注目。因为这一系统充满了"你死我活"的矛盾和斗争，优胜者得对生存和发展，失败者遭致危害和毁灭。人们可以通过这一系统，从正反两个方面去研究的利用"生命之战"的拮抗体系为人类服务。例如，蛭弧菌对宿主细胞周质空间的高度适应力的致死力，不论对致病的有害细菌还是非致病的有益细菌都是相等的。

2、在水产养殖中的应用

当今，人们对健康的水产品的需求量日益增长,但是我国的水产养殖业片面地追求降低饲料系数、提高产量追求经济利益,从而无节制地使用抗生素、化学药物来防治病害,使养殖环境不断遗到破坏,出现水体富营养化、重金属污染、药物残留超标等现象,加之自然环境的日益恶化，导致水生动物疾病频发,我国水产业每年因病害造成的经济损失约为140亿元,其中细菌性疾病尤为严重,约占水产养殖病害的46%。蛭弧菌以其天然、无污染、无残留的特点在水产养殖业中具有广阔的发展前景,有望成为抗生素的替代品，减轻抗生素滥用带来的各种困扰,减少抗生素滥用带来的巨大经济损失.蛭弧菌已经成为水生动物健康、生态、高效养殖的新工具。

（1）改善养殖水质

随着我国水资源污染加重,河流、湖泊等养殖水源遭到破坏,养殖水质面临严重的问题。在养殖过程中,水生动物排泄物以及剩余饵料不断积累，一旦水体中有机物增加的速度大于水体自净的速度,就会使溶解氧下降,氨氮、亚硝酸态氮上升，致病微生物大量繁殖,导致疾病频发、水生动物生长发育异常,造成巨大经济损失。蛭弧菌制剂发酵过程中产生的代谢产物可分解、转化水中的亚硝酸盐,改善养殖水体水质,减少蛋白态氮向氨和胺转化,从而减轻水中氨和有机质污染。

曲疆奇等研究表明,蛭孤菌微生态制剂可有效利用养殖水体中的含氯化合物,使养殖水体中的氨氮、亚硝酸态氮快速降解,有效改善养殖水质。张梁等在草鱼养殖池加入蛭弧菌后发现,水体主要水化指标具有明显改善,试验组的平均化学耗氧量、氨氮、硫化物显著低于对照组,溶解氧显著高于对照组，池水细菌总数及病原菌的数量也随着蛭弧菌浓度的增加呈几何级数减少。陈家长等研究发现,蛭弧菌和光合细菌联合使用对中华绒整蟹养殖水质有改善作用，细菌总数由6.3X106cfu/L降至2.6X103cfu/L,试验组池塘的氨氮、硫化物含量以及化学需氧量均明显下降。

（2）预防水生动物细菌性疾病

抗生素的长期使用容易使病原菌产生耐药性，利用蛭弧菌对病原菌独持的寄生和裂解特性，可有效清除养殖水体及水生动物体内的病原菌减少病原菌数量,使其无法达到致病密度，以达到防治病害、提高成活率的效果。因此,蛭弧菌具有取代抗生素的潜力,成为控制水生动物疾病的新手段。蛭弧菌作为水体自净的生物因子,可有效清除河水中的大肠杆菌、沙门氏菌和不凝集弧菌,清除率均在90%以上。张吕平等研究证实,蛭弧菌对凡纳滨对虾养殖水体中弧菌的杀灭效果显著优于二氯异氰尿酸和季铵盐络合碘消毒剂,可有效预防凡纳滨对虾弧菌病的发生。

（3）治疗水生动物细菌性疾病

水产养殖业频频遭到细菌性疾病的侵袭,甚至引发了大规模的死亡,限制了水产养殖业的健康发展。水生动物细菌性疾病的病原菌以气单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属为主,这3个属细菌均为革兰氏阴性菌,能被蛭弧菌裂解，且裂解率高达70%以上。生产上可利用蛭弧菌对革兰氏阴性菌的裂解特性治疗水生动物细菌性疾病。秦生巨利用蛭弧菌制剂治疗由弧菌引起的大菱鲆出血病,结果证明连续使用复合蛭弧菌制剂3d,267尾严重出血的大菱鲆的治愈率为98.7%.效果显著。陈丽芸等使用蛭弧菌治疗由假单胞菌属,弧菌属中的某些菌种为主要病原菌引起的大菱鲆红嘴病,低密度组(103pfu/mL)7d基本达到治愈红嘴病的效果,高密度组(107pfu/mL)能在5d内治愈全部患病大菱鲆,蛭弧菌密度越高，红嘴病痊愈越快。黄立斌等试验证实,蛭弧菌能够明显降低鲫鱼感染嗜水气单胞菌的发病率和死亡率，使用蛭弧菌的试验组鲫鱼存活率达30%以上，而对照组全部死亡。蛭弧菌不如抗生素效应快,其制剂4~6h才能效应,但作用效果能持续15d以上,这一点显著优于抗生素及其他化学药物。但是当发生爆发性强.发病急的细菌性疾病时，蛭弧菌的效应时间较长，难以达到治疗的效果。所以使用蛭弧菌应以预防为主，并在细菌性疾病发病初期使用。

（4）提高水生动物免疫活性

免疫系统是机体的防御系统，其防御功能的高低，直接影响到机体的抗病能力和生产能力。尤其是虾类、贝类等低等无脊椎动物，其免疫系统进化程度低，仅由少量免疫器官、免疫细胞和免疫因子组成,缺乏特异性免疫应答。蛭弧菌进入水生动物肠道后，在聚糖酶、肽酶等酶的作用下释放细胞壁中的肽聚糖或者其它免疫物质,从而发挥免疫增强剂的功能，刺激溶菌酶活性,增强与鱼类免疫功能相关酶活性。

（5）用于水产品保质

水产品是人类重要的蛋白源，然而在种类繁多的水产品中存在多种危害人体的病原菌,如大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、沙门氏菌等,这些细菌是引起食物中毒的主要原因。因此,水产品保质是水产加工业发展过程中非常重要的一个环节，也是关系到水产品品质和经济效益的重要问题。蛭弧菌能够通过裂解引起水产品变质的病原菌,达到水产品长期保鲜的目的。

六、应用中存在的问题

虽然蛭弧菌在改良水质、疾病防控、水产品保质等方面具有良好的应用效果,但蛭弧菌在水产养殖应用中依然存在诸多问题，这些问题也制约了蛭弧菌的广泛使用。

其中主要存在的问题包括：

(1)国内外关于蛭弧菌的研究主要集中于应用,而忽略了基础理论研究的重要性，例如,蛭弧菌吸附于宿主菌表面的识别位点以及不可逆结合的具体反应仍然有待研究,蛭弧菌裂解机理的研究还需完善。

(2)水产用蛭弧菌制剂的剂型较为单一,而单一的高密度蛭弧菌在水体中的作用时间较短,需要频繁加入才能维持控菌效果,而且生产上使用的绝大多菌种为通用菌种,对适用对象及范围缺乏针对性。

(3)尚未建立一种简易的蛭弧菌筛选方法，使用的蛭弧菌制剂效率较低,并且会因为抗生素等药物的使用而失活。今后应该加强关于蛭弧菌筛选方法的研究,以获得针对不同养殖品种、不同生长时期、不同环境条件的耐药性较强的蛭弧菌菌株，并使其作用更专一。

(4)蛭弧菌增殖速度较慢,不同蛭弧菌的宿主菌裂解谱存在差异性,如何使其增殖速度更快、裂解谱更广也是一个有待解决的问题。因此,高效增殖方法以及扩增蛭弧菌的裂解谱研究甚为迫切。

(5)蛭弧菌在生产应用中发挥作用的有效剂量还缺乏研究,在水产养殖中蛭弧菌的使用量也多是基于经验,尚无科学依据。

(6)实验室条件下多运用液氮超低温法、冷冻真空干燥法保藏蛭弧菌,关于蛭弧菌持效稳定、适合生产应用的保藏方法的研究甚少。

(7)许多细菌都有天然的转化能力,频繁的使用蛭弧菌可以提高其与病原菌发生有害基因水平转移的可能性,使蛭弧菌转变成新的有害菌,产生新的问题，因此蛭弧菌使用的安全性方面值得注意。

(8)研究主要强调了蛭弧菌的实验室条件下的应用效果,这些试验不能支撑蛭弧菌在不同养殖品种、不同水质条件的实际生产中的科学应用。因此,蛭弧菌制剂的应用技术研究有待加强。

蛭弧菌制剂产品仍不够成熟，上述存在问题制约着蛭弧菌在水产养殖业的发展。因此，解决这些问题并选育出高效广谱、适应能力强、耐药性强、增殖快的菌种将是今后对蛭弧菌研究的重点。

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