鲁氏不动杆菌PCR试剂盒的背景与应用及使用方法！

                 鲁氏不动杆菌PCR试剂盒的背景与应用及使用方法！

一、背景

鲁氏不动杆菌PCR试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。

二、鲁氏不动杆菌PCR试剂盒使用方法

（一）样品DNA的制备

1、用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站订购核酸释放剂。

2、如果有N个样品，则需要做N+2个提取，包括一个样品制备阳性对照和一个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求的样品起始量）中加10μL鲁氏不动杆菌PCR阳性对照的1000倍稀释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板DNA放冰上待用。

（二）设置PCR反应（40μL体系）

3、对N+2个样品，在PCR时需要增加一个PCR阳性对照和一个PCR阴性对照，故需要设置N+4个反应。

（三）电泳检测

4、取10-20μL PCR产物。电泳检测PCR产物。本产品提供的PCR Mix在扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加loading buffer。PCR产物阳性对照必须有预期条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释10倍后重复PCR扩增以排除PCR抑制剂的感染。

三、应用

鲁氏不动杆菌PCR试剂盒可以用于基于微生物组学和代谢组学的腺性膀胱炎发病机制研究：

建立基于差异菌群、差异代谢物的疾病诊断模型。分析差异菌群与差异代谢物之间的相关关系,阐释腺性膀胱炎的发病机制。

材料与方法：

1、生物样本收集。主要包括腺性膀胱炎患者及正常对照人群的尿液、粪便及血液标本的收集。腺性膀胱炎患者的入组标准为：

(1)病理确诊为腺性膀胱炎;

(2)因性别因素影响实验结果,本研究全部纳入男性患者;

(3)年龄在20-70岁之间;(4)BMI要求在18.5-24之间;(5)签署知情同意书,并经上海长海医院伦理委员会批准认证。

正常对照组的入组标准为：

(1)2017年1月至2018年12月期间于上海长海医院体检中心体检,体检结果正常;

(2)全部纳入男性;

(3)年龄在20-70岁之间;(4)BMI要求在18.5-24之间;(5)签署知情同意书,并经上海长海医院伦理委员会批准认证。近1个月内接受抗生素治疗或长期食用益生菌类食品的腺性膀胱炎患者或健康人均不能纳入本研究中。

2、微生物多样性测序：

(1)基因组DNA抽提和质检使用基因组DNA抽提试剂盒提取尿液、粪便、血液标本的基因组DNA,提取方法严格按照试剂盒说明书进行操作。基因组DNA完成提取后,利用紫外微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量。

(2)引物的设计合成细菌16S rDNA扩增选择区域为V3-V4区,使用的通用引物为341F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。

(3)PCR扩增及产物纯化以稀释后的基因组DNA为模板,使用鲁氏不动杆菌PCR试剂盒对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增,采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。切取目的片段后采用凝胶回收试剂盒回收目的片段。

(4)PCR产物的定量化、均一化对PCR产物进行定量,根据单个样品所需的数据量要求,按照相应比例进行混合。

(5)上机测序利用Illumina公司的Miseq平台进行微生物多样性测序,而后进行生物信息学分析。将获得的原始数据进行拼接和质控,将Reads按照丰度由大到小排列,得到运算分类单元(OTUs),然后对每个样品的Reads进行随机抽平,接下来进行Alpha多样性指数稀释曲线分析,对每个OTU进行物种分类。分类后,依据每个OTU中序列的条数得到OTU丰度表,依据OTU丰度表进行后续生物信息学分析。

(6)生物信息学分析微生物多样性测序的生物信息学分析主要包括对各个样本在不同分类水平的组成进行分析;分析不同样本间及不同分组间的菌群结构的差异;根据差异菌群,构建疾病的诊断模型并评估模型的诊断效能;依据16S rRNA基因测序结果,预测样本的菌群代谢功能。

3、代谢物组学分析：

(1)生物样本收集主要包括腺性膀胱炎患者及正常对照人群的尿液及粪便标本的收集。腺性膀胱炎患者及健康正常人的入组标准同上述微生物学多样性测序中的入组标准。

(2)上机检测尿液代谢组学分析采用LC-MS分析,LC-MS分析使用Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱与Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF质谱联用仪。菌群与宿主肠道共代谢物检测使用的仪器是气相色谱—飞行时间质谱(GC-TOFMS,Pegasus HT,Leco Corp.,St.Joseph,MO,USA)

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