正常大鼠肾细胞的应用与培养步骤及实验方法！

                   正常大鼠肾细胞的应用与培养步骤及实验方法！

一、背景

正常大鼠肾细胞是一种常用的细胞系，源自大鼠肾脏组织，并通过克隆培养而得来。该细胞系具有上皮细胞样的形态，并具有贴壁生长的特性。

正常大鼠肾细胞在体外培养时，推荐使用DMEM培养基，并添加5%的胎牛血清和1%的双抗。该细胞系的传代比例通常为1:2，并在消化2-3分钟后进行。

正常大鼠肾细胞的生长特征是每周可以倍增2至3次，其冻存条件为使用90%的FBS和DMSO的混合液作为冻存液，温度为液氮。

正常大鼠肾细胞广泛用于科学研究，特别是在肾病研究领域中具有重要作用。然而，它并不应用于动物或人类疾病的治疗。

二、正常大鼠肾细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、正常大鼠肾细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）正常大鼠肾细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

正常大鼠肾细胞可以用于内质网应激和自噬对顺铂诱导NRK-52E细胞凋亡的影响：

通过体外复制“顺铂(Cisplatin)致NRK-52E细胞损伤模型”来模拟顺铂肾毒性,探究顺铂致肾小管上皮细胞凋亡的可能机制,并观察利用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)、自噬抑制剂氯喹(CQ)后肾小管上皮细胞的凋亡情况,为研究其医治靶点奠定理论基础。

实验方法：

1、MTT法检测Cisplatin对NRK-52E细胞活性的影响;

2、Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术检测NRK-52E细胞凋亡率;

3、Western blot检测cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、LC3-Ⅱ的表达;

4、RTCA检测细胞增殖;5.Hoechst染色观察细胞核形态。

实验结果：MTT法检测结果显示,顺铂对细胞活性的影响呈剂量依赖性;流式细胞术结果显示,Cisplatin及联合TUDCA、CQ能增加NRK-52E细胞凋亡率;Western blot结果显示,顺铂组凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达高于对照组;RTCA检测结果显示,与对照组的生长曲线相比,顺铂组、TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组的生长曲线明显下降,且TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组下降更明显;Hoechst染色结果显示,顺铂组、TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组,与对照组相比,凋亡核阳性细胞数目明显增加。

实验结论：

1、顺铂致肾小管上皮细胞损伤引发内质网应激、自噬。

2、抑制内质网应激、抑制自噬,明显增加了顺铂对肾小管上皮细胞的损伤,诱导细胞凋亡。

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