SNU-398人肝癌贴壁细胞系的培养条件与操作步骤！

               SNU-398人肝癌贴壁细胞系的培养条件与操作步骤！

一、背景

SNU-398人肝癌贴壁细胞系于1990年由J.-G.Park及其同事取自一名韩国患者的间变性肝细胞癌，该患者已通过脂质体加多柔比星和丝裂霉素-C的组合进行了经导管动脉栓塞治疗。既可以附着细胞也可以悬浮细胞。悬浮的细胞是可行的，不应丢弃。通过温和离心(125 xg)回收悬浮细胞，以与贴壁细胞群一起进行继代培养。

二、SNU-398人肝癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

注：上皮样细胞，多数贴壁，悬浮细胞和贴壁细胞同时存在。传代冻存时请收集悬浮细胞。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三、SNU-398人肝癌贴壁细胞系培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）SNU-398人肝癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）SNU-398人肝癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

SNU-398人肝癌贴壁细胞系可以用于SKA3促进肝癌细胞“干性”的实验研究：

观察SKA3对肝癌细胞“干性”的影响并初步探讨其分子机制。

方法：

(1)首先依据对TCGA数据库分析后的结果,采用Western blot检测32例肝癌患者中SKA3在癌和癌旁组织中的表达差异,并进行临床预后的相关性分析;

(2)分别用si RNA、SKA3过表达质粒下调或上调肝癌细胞中SKA3的表达,通过浮球培养实验、Sorafenib抵抗实验、平板克隆实验、CCK8实验及Transwell迁移侵袭实验观察肝癌细胞“干性”生物学行为的变化;

(3)病毒构建稳定转染SKA3低表达或高表达的MHCC-97h细胞后,我们利用有限稀释法进行了裸鼠皮下成瘤实验,体内实验进一步观察SKA3对肝癌细胞“干性”生物学行为的影响;

(4)最后采用Western blot检测上调或下调SKA3后肝癌细胞Notch信号通路关键分子如Notch1、NICD等表达的变化;再使用慢病毒敲低MHCC-97h中的Notch1,检测SKA3对肝癌细胞增殖及迁移能力的影响,初步探讨其分子机制。

结果：

(1)发现SKA3在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,且通过生物信息技术分析发现SKA3与肝癌患者生存时间、临床病理分期呈正相关;

(2)在肝癌细胞MHCC-97h、SNU-398人肝癌贴壁细胞系下调SKA3表达后,si SKA3组与NC组相比,其自我更新能力(SNU-398人肝癌贴壁细胞系:P<0.01)、化疗抵抗能力(MHCC-97h:P<0.0001;SNU-398人肝癌贴壁细胞系:P<0.001)、克隆形成能力(MHCC-97h:P<0.001;SNU-398:P<0.01)、增殖能力(MHCC-97h:P<0.0001;SNU-398:P<0.0001)、迁移(MHCC-97h:P<0.01;SNU-398人肝癌贴壁细胞系:P<0.01)及侵袭能力(MHCC-97h:P<0.001;SNU-398人肝癌贴壁细胞系:P<0.01)均显著减弱。相反在肝癌细胞上调SKA3表达后,上述肝癌细胞“干性”化能力均明显增强,结果均具有统计学意义;

(3)裸鼠成瘤实验显示,MHCC-97h下调SKA3表达后,裸鼠皮下瘤体积小于对照组(P<0.05),而上调SKA3表达后,裸鼠皮下瘤体积大于对照组(P<0.05);(4)Western blot检测发现下调SKA3后,肝癌内Notch信号通路关键分子Notch1、NICD、Hes1表达明显减少,而上调SKA3后,上述Notch信号通路分子表达显著增高。抑制Notch信号通路后,SKA3对MHCC-97h的增殖能力(P<0.01)及迁移能力(P<0.01)的促进作用均被抑制。

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