小鼠肺微血管内皮细胞的传代与培养及鉴定方法！

                  小鼠肺微血管内皮细胞的传代与培养及鉴定方法！

一、背景及概述

内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。小鼠肺微血管内皮细胞分离自肺组织；肺是机体的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆盖于心之上。肺有分叶，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍。微血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。细胞呈梭形或多角形，形成单层后呈鹅卵石样或铺路石样排列。小鼠肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。

二、细胞传代培养

将长成单层的原代细胞加0.5g/L胰蛋白酶0.2g/LEDTA后置37℃培养箱进行消化5min左右，镜下观察，当细胞间连接疏松时立即加入ECM培养基，吹打使细胞脱落并充分混匀，按1∶1比例传代。

三、细胞纯化

肺微血管内皮细胞在组织块取出后，可以看到局部有成纤维细胞的生长，采取机械刮擦的方法和ECM培养基的定向分选功能进行纯化。

四、细胞鉴定

用细胞免疫组化法检测ⅧF-Ag和CD31膜抗原将汇合度达80%的96孔板细胞，PBS洗3次。40g/L多聚甲醛固定30min。ⅧF-Ag组需加2。5mL/LTritonx-100，30～40μL/孔，10min，PBS洗5min×3次。然后加H2O2(300mL/L的H2O2甲醇=1∶50)，室温30min，PBS洗5min×3次。BSA封闭30min。吸去BSA，直接加CD31和ⅧF-Ag，对照组加相同体积的PBS，盖底即可，4℃过夜。第2日，吸去一抗，PBS洗5min×3次。加二抗，室温20min，PBS洗5min×3次。加SABC30～40μL/孔，室温20min，PBS洗5min×4次。加DAB30～40μL/孔，5～30min，显微镜观察染色程度。PBS洗3～5次。苏木精染色1～2min，用荧光倒置显微镜拍照，BiosensDigitalImagingSystem灰度扫描仪扫描以检测ⅧF-Ag和CD31膜抗原水平。

五、相关研究

有实验研究藻酸双酯钠(PSS)对脂多糖(LPS)所致的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)损伤的保护作用。方法体外培养PMVEC，随机将细胞分为空白对照组(C组)、LPS刺激组(L组)、PSS+LPS组(LP组)。采用MTT法检测PSS对LPS刺激PMVEC的细胞活力的影响，虎红染色法测定中性粒细胞(PMN)对PMVEC黏附数量的影响，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测3组培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的浓度。结果PSS能抑制LPS所致的PMVEC细胞活力下降；与C组比较，L组的PMVEC与PMN的黏附数量明显增加，TNF-α和ICAM-1的表达显著增加；与L组比较，PSS预处理1h能显著降低LPS所致的PMVEC与PMN的黏附，LP组的TNF-α和ICAM-1表达显著降低。结论PSS能抑制LPS对PMVEC的损伤及PMVEC与PMN的黏附，其作用机制可能与降低ICAM-1和TNF-α的表达有关。

此外，还有实验研究热打击及10%中暑小鼠血清刺激肺微血管内皮细胞(PMVECs)对PMVECs表达血管内皮黏附分子(VCAM-1)和细胞间黏附分子(ICAM-1)水平及其黏附单核细胞能力的影响。

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