拟杆菌属通用PCR试剂盒的背景与应用及使用方法！

                 拟杆菌属通用PCR试剂盒的背景与应用及使用方法！

一、背景

拟杆菌属通用PCR试剂盒是一种生物试剂盒，用于检测拟杆菌属的特异性基因。这种试剂盒可以用来确认拟杆菌属的存在和种类。

二、拟杆菌属通用PCR试剂盒使用方法

稀释拟杆菌属通用PCR试剂盒阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1、注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2、标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4、在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5、换枪头，在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6、换枪头，在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7、重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

8、如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9、用自选方法纯化样品的DNA。

10、如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11、在标记管中按拟杆菌属通用PCR试剂盒说明书加入各成分。

12、盖上盖子后上机，按拟杆菌属通用PCR试剂盒说明书参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

13、具体操作按所用仪器推荐的流程进行。拟杆菌属通用PCR试剂盒中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

14、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

15、如果把拟杆菌属通用PCR试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

三、应用

拟杆菌属通用PCR试剂盒可以用于实时定量PCR检测血中肠道菌DNA及快速药敏试验的方法学研究：

建立利用实时定量PCR(RQ-PCR)检测血标本中肠道菌DNA的方法并对临床标本进行初步检测，并建立RQ-PCR快速检测肠道菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素敏感性的方法，以期能初步了解外科发热患者中肠道菌菌血症的现状，并建立快速药敏方法以便有利于指导治疗。

选择脆弱拟杆菌谷氨酰胺合成酶基因作为靶基因设计引物和TaqMan探针，使用拟杆菌属通用PCR试剂盒建立20μl的RQ-PCR反应体系，采用含靶基因特异性扩增片段的重组质粒建立标准曲线，并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因组DNA，建立实时定量PCR检测血标本中脆弱拟菌DNA的方法学，并对32份外科发热患者的标本进行了临床验证。结果显示引物和探针特异性好，检测灵敏度为10°拷贝／μl(103CFU／ml)，标准曲线相关系数在0.985～0.999之间。

不同浓度的脆弱拟杆菌样本检测的平均准确性为(107.30±2.11)％；批内及批间重复性平均变异系数(CV)分别为(18.44±1.16)％和(19.00±4.47)％。血标本中脆弱拟杆菌DNA平均提取效率为(60.13±5.66)％，提取效率平均变异系数为(15.62±2.47)％。含有同等量脆弱拟杆菌的临床血标本存放在-20℃或-70℃6个月内，脆弱拟杆菌DNA拷贝数差异无显著性(P=0.467～0.840)，该方法可用于临床标本的脆弱拟杆菌DNA检测，并具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点。

采用此方法学对32例外科发热患者的84份血标本进行了实时定量PCR检测。结果显示10个标本检测到脆弱拟杆菌，阳性率约为11.90％，含量约1.78～9.24×103CFU／ml，所有患者的血培养结果均为脆弱拟杆菌阴性。

在含有相同浓度大肠杆菌的LB液体培养基和血中，分组加入不同的抗生素，并设立生长对照，分别培养1、2、3、4小时后提取标本的基因组DNA，以本研究组先前建立的实时定量PCR检测大肠埃希菌DNA的方法，对标本进行检测，观察不同抗生素组和生长对照组的生长曲线，来判定药敏结果，并与纸片法进行比较。

结果显示实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素的药物敏感性，结果与常规纸片法一致，但更快速。

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