人子宫鳞癌细胞(高分化)的背景与应用及培养操作！

                人子宫鳞癌细胞(高分化)的背景与应用及培养操作！

一、背景

人子宫鳞癌细胞(高分化)1995年建系，人宫颈高分化鳞癌裸小鼠移植瘤HCC94V第2代瘤组织，贴壁培养，6日细胞开始生长，首次传代38日，BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下移植成瘤。

二、人子宫鳞癌细胞(高分化)培养操作

1）复苏人子宫鳞癌细胞(高分化)：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人子宫鳞癌细胞(高分化)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人子宫鳞癌细胞(高分化)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人子宫鳞癌细胞(高分化)可以用于极光激酶A对宫颈鳞状细胞癌的影响及其机制研究：

用极光激酶A选择性小分子抑制剂MLN8237联合DPP、多西他赛对宫颈鳞状细胞癌细胞系(HCC94、SiHa)的体外影响,并检测MLN8237对宫颈永生化细胞系H8的影响以检测MLN8237对正常细胞的毒性反应,同时探讨用极光激酶A抑制剂对宫颈鳞状细胞癌放射治疗的影响及对化放疗增敏的机制。

方法：

1)采用免疫组化方法检测极光激酶A在未接受任何治疗的129例初始接受根治性放射治疗的维吾尔族宫颈鳞状细胞癌患者组织中的表达水平,放射治疗给予外照射+内照射(A点剂量70-85Gy)伴或不伴顺铂为基础的化疗,分析极光激酶A不同表达水平对预后意义。

2)以MLN8237,DPP,多西他赛,各单药组作用于HCC94、Si Ha细胞,并设调零组及不加药对照组,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率;

3)以MLN8237高剂量处理H8细胞,MTT比色法检测细胞的增殖抑制率。

4)以各药物小剂量浓度联合作用24h,采用MTT比色法测各组HCC94、Si Ha细胞的增殖抑制率。

5)以三者1/2 IC50(48h)组合,IC50(48h)组合,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率。

6)以克隆形成实验验证以上MTT结果。

7)以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy放射剂量单独或联合MLN8237观察HCC94、Si Ha细胞平板克隆形成率,利用单击多靶模型拟合生存曲线,并计算外推值N,平均致死剂量D0和准阈剂量Dq以及放射增敏比SER。

8)流式检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞后细胞周期、凋亡。MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,设立对照,划痕检测迁移能力。MLN8237处理HCC94、Si Ha细胞,Q-PCR检测极光激酶A mRNA的变化,蛋白印迹检测极光激酶A蛋白、磷酸化(T288)极光激酶A蛋白的变化。

结果：

1)极光激酶A表达水平与宫颈癌不良预后相关的因素相关,包括淋巴转移(P<0.001),肿瘤体积大(P<0.001),低血红蛋白水平(P=0.011)和复发(P<0.001)。极光激酶A高表达和低表达临床放射治疗反应有差异,极光激酶A高表达患者放射治疗反应相对抗拒(P<0.001)。单因素分析显示淋巴转移、肿瘤大、低血红蛋白水平、极光激酶A过表达影响无复发生存和总生存。然而,多因素分析显示只有极光激酶A高表达可作为无复发生存(hazard ratio,3.953;95%CI,1.473-10.638;P=0.006)和总生存(hazard ratio 9.091;95%CI 2.597-32.258;P<0.001)的独立预后因素。

2)MLN8237单药处理细胞时,各组对HCC94、Si Ha细胞生存率均比对照组降低(P<0.05),随着给药时间延长,细胞存活率逐渐降低(P<0.05)。DPP、多西他赛也呈同样趋势。与对照相比,MLN8237的浓度高达80uM时没有引起H8细胞活性降低(P>0.05),甚至高达320u M时仅导致小量毒性(细胞存活率85%)。

3)MLN8237与DDP或者多西他赛联合处理各细胞24h时,各浓度联合作用组均较相同浓度单药存活率降低(P<0.05)。MLN8237与DDP或者多西他赛联合组各药物之间有交互作用,各药物最高浓度联合组效果最好。三药1/2 IC50(48h)浓度联用HCC94、SiHa细胞存活率分别仅为15.859±4.657%,18.678±5.387%;三药IC50(48h)联用HCC94、Si Ha细胞存活率更低分别仅为6.957±5.846%,9.561±6.241%。进一步在平板克隆形成实验中也得到证实。

4)单击多靶模型绘制出细胞辐射存活曲线,可见无论是HCC94细胞,还是SiHa细胞,联合组曲线较单纯照射组左移,且较为平直,“肩区”不明显。

5)划痕实验检测MLN8237处理24h细胞,与对照组比较,明显抑制细胞迁移。流式细胞周期检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,G2/M期明显增加,多倍体细胞比例明显增高,G0/G1+S期比例明显降低(P<0.05);流式细胞凋亡检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,凋亡细胞明显增多(P<0.05),并随时间和剂量增加,变化越明显。

6)MLN8237处理前后极光激酶A mRNA未见显著性差异,极光激酶A蛋白也未见明显变化,(T288)磷酸化极光激酶A蛋白表达显著被抑制,甚至表达消失。

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