人肝内胆管癌细胞的处理方法与培养步骤及应用！

                  人肝内胆管癌细胞的处理方法与培养步骤及应用！

一、背景

人肝内胆管癌细胞源自一位女性肝胆管细胞癌患者，呈上皮细胞样。HCCC-9810细胞染色体模式数为71，但其染色体数目可以在22-117的范围内变动。HCCC-9810细胞倍增时间为20.4小时；细胞内AFP、CEA和CA19-9的分泌水平低，HCCC-9810细胞在裸鼠中的成瘤率为20%。

二、人肝内胆管癌细胞的培养

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人肝内胆管癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人肝内胆管癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三、人肝内胆管癌细胞处理

1）冻存人肝内胆管癌细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人肝内胆管癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人肝内胆管癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

四、应用

人肝内胆管癌细胞可以用于谷氨酰胺酶2介导MDR1表达调控肝内胆管癌细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的研究：

探讨GLS2在ICC中的化疗耐药的作用及其潜在机制。

方法：首先,通过UALCN在线分析工具在生物信息数据库中检索ICC中GLS2、MDR1表达水平及两者的相关性。运用Western blot、免疫组化临床进一步验证40例ICC组织、癌旁组织GLS2和MDR1表达水平及两者相关性并分析,GLS2表达水平与临床病理因素及患者预后之间的相关性。然后,过表达RBE细胞GLS2表达,Western blot验证过表达效率。之后使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测过表达GLS2细胞及NC细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。

最后,Western blot检测过表达GLS2的ICC细胞及NC细胞MDR1的表达,初步阐明GLS2调控ICC化疗耐药潜在分子机制。

结果：

1、数据库分析结果显示在ICC癌组织中GLS2表达水平显著低于正常肝组织,而MDR1表达水平显著高于正常肝组织,并且GLS2表达与MDR1表达呈负相关。进一步Western blot和免疫组化验证,可以得到与之前一致的结果。GLS2蛋白表达与肿瘤数量、包膜、淋巴结转移、临床分期有关,GLS2表达越高,ICC患者预后越好。

2、上调RBE细胞GLS2表达后,可显著提高RBE细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性。

3、上调RBE细胞GLS2表达后可显著降低MDR1表达。

结论：GLS2通过介导MDR1表达提高ICC细胞对5-氟尿嘧啶化疗敏感性化疗敏感性,并且GLS2的表达越高提示患者预后越好。

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