DT40鸡淋巴瘤细胞的知识与应用及培养操作步骤！

                  DT40鸡淋巴瘤细胞的知识与应用及培养操作步骤！

一、背景

DT40鸡淋巴瘤细胞是来自Hyline SC鸡法氏囊淋巴细胞株经鸟类白血病病毒诱导建株的。原始淋巴瘤用罗氏相关病毒1(RAV-1)感染出生１天的小鸡得到。法氏囊中生成的肿瘤制成细胞悬液后通过静脉注射输入同基因型的受体小鸡。经过一次体内移植后，建立了DT40细胞株。这株细胞包含的前病毒基因整合在c-myc原癌基因的上游，表达的c-myc RNA水平较高。它缺少一个正常c-myc基因，但含有两个拷贝ALV去调控的myc基因。这株细胞保留了重排免疫球蛋白轻链基因(IgL)的能力。

在IgL位点，DT40包含一个重排和一个胚系同源基因。c-rel基因和v-rel癌基因在DT40细胞株中都能诱导组织相容性(MHC)II类抗原表达。v-rel诱导的MHCII表达比c-rel诱导快，且其有效性在数周后达到c-rel的50倍。这株细胞呈淋巴母细胞表型。传染性检测表明DT40释放低水平的传染性RAV-1。这株细胞可以用于稳转研究。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；鸡血清，5%；b-巯基乙醇，0.05mM；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。

1.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于REV感染对HD11和DT40细胞凋亡相关因子表达的影响研究：

针对REV免疫抑制的特征,选取HD11（鸡巨噬细胞系）和DT40（鸡淋巴瘤细胞）为研究对象,应用分子生物学技术和免疫学方法结合检测试剂盒,通过对REV感染上述细胞后病毒载量、细胞线粒体膜电位和Ca2+含量及细胞凋亡率等进行检测,同时测定了细胞线粒体途径重要凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA表达和蛋白含量变化。

主要研究结果如下：

（1）于REV感染的HD11、DT40细胞中均检测到了该病毒,表明REV可在HD11和DT40细胞中复制增殖。且在病毒感染HD11细胞后48 h,病毒载量到达峰值;REV感染DT40细胞后12-72 h,其病毒载量均呈上升趋势。

（2）REV感染HD11细胞后24-36 h,其细胞活力极显著（P<0.01）低于对照细胞。REV感染DT40细胞后,其细胞活力在12 h显著（P<0.05）低于对照细胞,在48h极显著（P<0.01）低于对照细胞。

（3）REV感染HD11和DT40细胞后,其细胞线粒体膜电位分别在病毒感染后36-48 h、36-72 h显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）低于对照细胞。

（4）REV感染HD11和DT40细胞后,其细胞内Ca2+含量均在36 h和48 h显著（P<0.05）高于对照细胞;其余时间点虽也高于对照细胞,但无统计学意义（P>0.05）。

（5）REV感染HD11细胞后24-36 h和72 h,其细胞凋亡率均极显著（P<0.01）高于未感染病毒的对照细胞,12 h虽然病毒感染细胞凋亡率较对照细胞有所增加,但无统计学差异（P>0.05）;REV感染DT40细胞后12 h、48 h和72 h,DT40细胞凋亡率极显著（P<0.01）高于对照细胞。

（6）REV感染HD11细胞后,其Bcl-2 mRNA表达在24-36 h极显著（P<0.01）低于对照细胞,而48-72 h显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于对照细胞;Bax mRNA表达在24 h显著（P<0.05）低于对照细胞,在48 h和72 h显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于对照细胞;caspase-3 mRNA表达在36 h和72 h极显著（P<0.01）高于对照细胞;caspase-9mRNA表达在12 h、36 h和72 h显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于对照细胞。

REV感染DT40细胞后,其Bcl-2 mRNA表达在12 h、48-72 h均极显著（P<0.01）高于对照细胞;Bax mRNA在12-72 h期间均未能检测到表达（Ct值≥35）;caspase-3 mRNA表达在24 h极显著（P<0.01）高于对照细胞,在36 h和72 h显著（P<0.05）高于对照细胞;caspase-9 mRNA表达在24-36h极显著（P<0.01）高于对照细胞,在72h显著（P<0.05）高于对照细胞;其他均未见统计学差异（P>0.05）。

北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得最优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！