人肺腺癌细胞的主要应用与培养操作及相关研究!
一、背景
人肺腺癌细胞源自一位男性肺腺癌患者。人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞是一株常用的肺癌细胞系,也被用于肺癌发病机理和抗肿瘤药物的体外研究试验研究;人肺腺癌细胞SPC-A-1细胞具有典型的上皮细胞状形态结构。
二、人肺腺癌细胞培养操作
1)复苏人肺腺癌细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)人肺腺癌细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)人肺腺癌细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为类;
1、细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。
3、将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人肺腺癌细胞可以用于蛇葡萄素钠体内、外协同卡铂抗SPC-A-1人肺腺癌细胞的作用及其机理研究:
研究蛇葡萄素钠(AMP-Na)单用及与卡铂(CBP)合用在体内、外对SPC-A-1人肺腺癌细胞的抗肿瘤作用及作用机制。
方法:建立人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型,评价AMP-Na单用及与CBP合用对荷瘤裸鼠在体的抑瘤作用;采用MTT比色法测定AMP-Na单用及与CBP合用对SPC-A-1细胞的体外细胞毒活性;用流式细胞仪分析AMP-Na单用及与卡铂联用后对SPC-A-1细胞调亡、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响。
结果:
1、体内实验表明,AMP-Na 125~260mg/kg各剂量单用对人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠皮下移植瘤生长无明显影响。与CBP合用,可显著增加CBP对SPC-A-1细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤活性,具有协同抑制作用,以AMP-Na 200mg/kgⅠ和260mg/kg作用最强,与溶媒对照比,差别有极显著性(P<0.01);与卡铂单用比,差别有显著性(P<0.05)。
2、体外细胞毒实验结果表明,AMP-Na 6.25~200μg/ml对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖的抑制作用具有明显的量效关系,与CBP联用后有协同效应,可显著增加CBP对SPC-A-1细胞的抑制作用,卡铂单用的IC50为35.69μg/ml±6.56μg/ml,联用后依次降为33.98±6.3、30.96±3.8、28.34±6.3、19.13±6.9和<6.25μg/ml。
3、FCM分析显示,AMP-Na 12.5~100μg/ml各剂量单用对人肺腺癌SPC-A-1细胞具有明显的诱导凋亡作用,与阴性对照比,差别有显著性(P<0.05);和CBP联用后凋亡率较卡铂单用明显上升,有协同抑制作用。
4、FCM分析显示,AMP-Na单用及与CBP联合作用后可显著提高SPC-A-1细胞Bcl-2与Bax的平均荧光强度,降低Bcl-2/Bax的比率,增加Caspase-3的表达。
结论:
1、AMP-Na单用对人肺腺癌SPC-A-1细胞裸鼠皮下移植瘤生长无明显影响;AMP-Na与卡铂合用,可以增强卡铂对裸鼠移植瘤的抗肿瘤活性,有协同抑制作用。
2、AMP-Na单用能够显著抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞的增殖,且有浓度依赖性;AMP-Na与卡铂合用可以增强卡铂的活性,协同抑制SPC-A-1细胞的增殖。
3、AMP-Na可能是通过激活细胞内的Caspase-3介导的信号转导通路,降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比率,诱导凋亡而发挥其抗肿瘤作用。
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