大鼠胶质细胞的背景与应用及培养步骤！

                    大鼠胶质细胞的背景与应用及培养步骤！

一、背景

OLN-93细胞系大鼠胶质细胞是一种大鼠胶质前体细胞系，来源于大鼠脑组织，OLN-93细胞系由原代大鼠脑胶质细胞培养中自发转化的细胞产生的。

二、OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：di一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

OLN-93细胞系|大鼠胶质细胞可以用于莫诺苷对Oln-93细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究：

莫诺苷是从山茱萸中提取出来的天然活性小分子物质,已有研究表明它对神经元有抗氧化抗凋亡的保护效果,但是对神经胶质细胞的作用报道甚少,因此,本实验采用Oln-93细胞(大鼠少突胶质前体细胞)作为研究对象,探究莫诺苷对Oln-93细胞氧化应激损伤的保护作用和作用机制,希望为神经退行性疾病的预防和治疗提供新的实验依据和思路。

方法：

1、建立Oln-93细胞氧化应激模型及药物处理:Oln-93细胞被孵育不同浓度的过氧化氢(H2O2),用MTT方法确定细胞的最适损伤浓度和处理时间;不同浓度的莫诺苷(Morroniside)预孵育细胞24h,用合适浓度的H2O2损伤,MTT法确定最适的加药浓度。

2、使用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化。

3、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒进行各组细胞毒性检测。

4、使用丙二醛(MDA)试剂盒检测各组细胞脂质氧化程度。

5、使用活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组细胞内ROS释放量。

6、应用JC-1荧光探针和荧光显微镜检测各组细胞线粒体膜电位(MMP)变化,观察细胞凋亡情况。

7、使用TUNEL试剂盒检测各组细胞TUNEL表达情况。

8、使用Hoechst33342活性细胞染色剂对细胞核染色观察各组细胞胞核形态变化。

9、提取各组细胞蛋白,进行Western Blot方法检测氧化相关蛋白i NOS、SOD2和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、AKT、P-AKT、Caspase3的表达情况。

10、应用AKT通路抑制剂LY294002,检测以上氧化和凋亡指标,进一步探讨莫诺苷的作用机制。

结果：

1、MTT法检测细胞活性,结果显示莫诺苷对H2O2诱导的细胞活性下降有明显的改善作用。

2、细胞形态学结果显示莫诺苷能明显改善H2O2损伤Oln-93细胞造成的破碎、皱缩等形态变化。

3、LDH细胞毒性检测结果表明,H2O2损伤后细胞释放LDH明显增多,莫诺苷能明显降低细胞LDH的释放。

4、脂质氧化检测结果显示,莫诺苷抑制细胞内脂质发生过氧化,显著减少H2O2诱导的MDA产量。

5、ROS检测结果表明,莫诺苷能显著降低H2O2诱导的Oln-93细胞的ROS释放量。

6、线粒体膜电位检测结果发现,莫诺苷能明显抑制H2O2诱导的线粒体膜电位的降低。

7、TUNEL检测结果表明,莫诺苷能明显减少H2O2诱导的TUNEL表达,对细胞凋亡有显著的抑制作用。

8、Hoechst33342染色结果表明,H2O2处理使细胞核呈现皱缩、破碎和不规则的凋亡形态,莫诺苷能明显减少发生凋亡的细胞数量。

9、Western Blot检测结果表明莫诺苷能显著降低i NOS表达,提高抗氧化蛋白SOD表达,并且能降低促凋亡蛋白Bax、Caspase3表达,提高抗凋亡蛋白Bcl-2和P-AKT表达。

10、应用LY294002孵育Oln-93细胞后进行检测。

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