人胰腺癌细胞的培养操作与应用及研究动态！

                   人胰腺癌细胞的培养操作与应用及研究动态！

一、背景

人胰腺癌细胞来自一个胰腺癌病人的腹水中的细胞移植到裸鼠后建立了这个细胞株。在本库通过支原体检测。人胰腺癌细胞通过STR检测。可以表达CEA，人胰腺相关抗原、人胰腺特异性抗原和黏蛋白。

二、人胰腺癌细胞培养操作

1）复苏人胰腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人胰腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1.人胰腺癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人胰腺癌细胞可以用于SPINK1慢病毒过表达载体和其稳转AsPC-1细胞株的构建及其对人胰腺癌细胞增殖的影响：

制作包含人SPINK1基因的完整编码区序列的慢病毒过表达载体,用此载体感染人胰腺癌AsPC-1细胞,并建立SPINK1过表达的稳转AsPC-1细胞株,以此来探索此基因在胰腺癌细胞中是否具有促进肿瘤细胞增殖和克隆形成的能力,并为今后进一步的研究奠定基础。

方法：首先构建SPINK1慢病毒过表达载体,包装病毒并产生病毒颗粒。应用PCR方法扩增SPINK1基因的全部编码序列,经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后切胶回收DNA,将其与慢病毒载体(pLenti-CMV-2A-GFP)同时用限制性内切酶酶切后,用T4 DNA连接酶进行连接,将构建好的人SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)进行转化,提取DNA进行酶切后,通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定。

用已鉴定正确的SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞产生病毒颗粒,过滤并高速离心浓缩病毒颗粒。然后用此病毒颗粒感染并建立SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株,使用嘌呤霉素(2ug/ml)药物筛选病毒感染后的阳性克隆并扩增,培养成SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株。

通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot的方法检测病毒感染后SPINK1基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达变化。

最后用CCK-8法、台盼蓝染色法、流式细胞仪检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力的影响,并通过平板细胞克隆形成实验来检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞克隆形成能力的影响。

结果：经酶切、琼脂糖凝胶电泳实验和基因测序鉴定,证实SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-h SPINK1-2A-GFP)构建正确。SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装混合质粒共转染293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到许多绿色荧光点,并伴有漂浮细胞和破裂细胞,感染效率可达90%。

用慢病毒颗粒感染AsPC-1细胞,经嘌呤霉素药物筛选出阳性克隆,将阳性克隆连续培养扩增数代后经Real-time PCR和Western Blot的方法检测,SPINK1基因可在AsPC-1细胞中稳定高效地表达,与阴性对照相比病毒感染后的SPINK1基因在mRNA水平与蛋白水平上的表达量分别上调了25倍和5倍。

在CCK-8实验中,SPINK1过表达AsPC-1细胞的光密度值为1.4 OD,对照组细胞的光密度值为1.0 OD,差异有统计学意义(P<0.001);台盼蓝染色检测细胞活性的实验发现,SPINK1过表达AsPC-1细胞的活性为(93.30±0.40)%,对照组细胞活性为(71.97±0.78)%,差异有统计学意义(P<0.001);

流式细胞仪检测细胞周期的实验中,SPINK1过表达AsPC-1细胞处于DNA合成期(S期)和DNA合成后期/分裂期(G2/M期)的DNA百分比为38.89%,与其对照的亲本AsPC-1细胞百分比为22.02%,差异有统计学意义(P<0.001);平板细胞克隆形成实验发现SPINK1基因上调的AsPC-1细胞克隆形成率为(9.70±0.66)%,对照的亲本细胞克隆形成率为(1.23±0.31)%,差异有统计学意义(P<0.001)。

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