人食管鳞癌细胞的背景与应用及培养操作步骤！

                 人食管鳞癌细胞的背景与应用及培养操作步骤！

一、背景

人食管鳞癌细胞从一位49岁，已经接受过放疗的日本女性患者的颈部食管中分离建立的低分化食管鳞癌。癌组织已侵袭至相邻组织。文献报道细胞携带有增多的癌基因C-ERB-B(8倍)和CYCLIN D1(4倍)并且细胞在裸鼠中能够成瘤。

人食管鳞癌细胞系集落不规则没有显著角质化的侵染性鳞状细胞癌。单层培养的细胞间可以观察到带状连接，也注意到有细胞质张力丝。1970年发现支原体污染并去除。肿瘤坏死因子（TNF）α抑制ME-180的生长。这株细胞含有人乳头瘤病毒（HPV）DNA，与HPV-39的同源性高于HPV-18。

二、人食管鳞癌细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人食管鳞癌细胞可以用于ZNF382抑制人食管鳞癌细胞生长与转移的功能与机制研究：

研究ZNF382在人食管鳞癌中的表观遗传学调控及抑制人食管鳞癌细胞生长与转移的功能与分子机制研究。

方法和结果：实时荧光定量PCR检测15对人食管鳞癌组织和癌旁组织中ZNF382的差异性表达,结果显示ZNF382在人食管鳞癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(p<0.05)。

MSP分别检测ZNF382在114例人食管鳞癌组织与3例正常食管上皮组织中的甲基化状态,发现87%的食管鳞癌组织发生了启动子区的甲基化,而在正常食管上皮组织中甲基化发生率只有33%。同时TCGA在线数据库分析183例食管鳞癌患者ZNF382表达水平差异与食管鳞癌患者5年总生存的相关性,发现ZNF382表达水平较高的患者,其5年总生存期较长。

进而通过一系列生物学功能实验分别在食管鳞癌细胞中外源性过表达ZNF382及敲低内源性ZNF382表达后,观察其对食管鳞癌细胞增殖,凋亡以及转移的作用。最后为进一步明确ZNF382在食管鳞癌中发挥细胞功能的具体分子机制,送检了RNA-sequence测序并结合GEO数据库的CHIP-Seq测序结果,联合生物信息学分析,RT-PCR验证,Western blot及双荧光素酶报告实验得出结论,ZNF382作为19q13.12的新抑癌基因通过直接结合到DVL2和FZD1基因的启动子区抑制Wnt/β-catenin信号通路活性从而在人食管鳞癌细胞中发挥抑癌功能。

结论：ZNF382是位于19q13.12的新抑癌基因,直接结合到FZD1和DVL2基因的启动子区抑制Wnt/β-catenin通路活性从而在人食管鳞癌细胞中发挥抑癌作用。

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