THLE-2人肝永生化贴壁细胞系的应用及相关研究！

               THLE-2人肝永生化贴壁细胞系的应用及相关研究！

一、背景

THLE-2人肝永生化贴壁细胞系是正常肝细胞用SV40大T抗原转染得到。将含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段的逆转录病毒载体导入兼嗜性包装细胞株PA317中生产病毒。THLE-2 and THLE-3表达正常成人肝上皮细胞特征性的表型。当注射到无胸腺裸鼠中时，它们不成瘤，具有接近二倍体的核型，不表达甲胎蛋白。

二、THLE-2细胞人肝永生化细胞培养操作

1）复苏THLE-2人肝永生化贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）THLE-2人肝永生化贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）THLE-2人肝永生化贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

THLE-2人肝永生化贴壁细胞系可以用于三氯乙烯诱导人肝细胞恶性转化的效应及机制研究：

三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一种生产环境中常见的有机污染物,属于人类Ⅰ类致癌物。

以人永生化肝细胞为模型,研究TCE诱导细胞恶性转化效应及其潜在机制,并根据筛选的靶分子设计合成新型姜黄素衍生物B5,进一步探讨B5对恶性转化的逆转效果,有望为TCE职业暴露预防与控制提供理论基础。

研究方法人永生化THLE-2暴露于5 mMTCE培养30代,获得THLE-2-TCE细胞。细胞水平研究细胞形态学、生长动力学、增殖迁移能力和基因组差异;动物水平观察THLE-2-TCE异种移植于BALB/c裸鼠后的成瘤潜力、新生物组织病理学和分子生物学(cytokeratin和Ki-67)。

随后通过氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)来探讨氧化应激的生成及其对细胞恶性转化过程的调控作用;在此基础上,结合Label free定量结果,采用通路蛋白抑制剂和si-RNA慢病毒干扰等技术探究TCE诱导细胞恶性转化的可能分子机制。最后,根据筛选的分子机制靶点(AKT、NFκB),利用孪药设计的化学方法合成新型姜黄素衍生物B5,通过分子对接和分子动力学模拟,综合评估B5逆转细胞恶性转化的效应并再次验证所筛选的靶分子机制。

研究结果(1)THLE-2-TCE细胞恶性转化相关生物学表征:

(1)形态学表征:THLE-2-TCE细胞部分重叠生长,细胞大小不一,呈长梭形且有长长的突起,可见多核巨细胞,细胞形态异化明显。

(2)生物功能表征:THLE-2-TCE细胞倍增时间(49.92±0.49 h)较对照组(75.06±1.71 h)明显缩短;克隆增殖能力增强;细胞24 h平均迁移率(76.67%)、穿膜细胞数目(525.00±13.04个)明显高于对照组(20.83%和114.00±6.78个),以上差异具有统计学意义(P<0.05)。

(3)生物表型改变:Label free蛋白定量结果显示THLE-2-TCE细胞基因组不稳定。细胞增殖分化、迁移侵袭和抗凋亡正相关蛋白(IGF2R、EIF4EBP1、FAM195B、ZNF185、BCAT1等)表达显著升高;原癌基因(AKAP8、BCL2L1、AXL、JUND、AKT2等)高表达,而抑癌基因(BCAR1、SAMD9、BCAR3、NFXL1、UIMC1等)表达显著降低。差异蛋白功能主要富集在物质间(如蛋白质、核酸、生物酶和杂环化合物等)的结合反应;氧化磷酸化、细胞存活和细胞周期等信号网络的共性通路,如TGFβ1/SMAD、MAPK、PI3K/AKT/m TOR和NFκB等通路异常活化。综合以上分析结果,表明THLE-2-TCE细胞具有恶性转化相关生物学活性。

(4)裸鼠成瘤实验:传代对照THLE-2细胞没有形成新生物,THLE-2-TCE细胞新生物形成率为40.00%,终点体积为406.17±76.98 mm3,HE染色显示细胞形态不规则,核深染,且异型较明显,但不及Hep G2阳性对照组显著。cytokeratin染色阳性,系上皮细胞来源。Ki-67阳性细胞比例较高,细胞增殖能力强。THLE-2-TCE细胞裸鼠荷瘤模型的建立,表明该细胞具有一定的体内成瘤潜能。

(2)THLE-2-TCE细胞恶性转化潜在分子机制:

(1)TCE染毒过程中,THLE-2细胞内ROS、gp91 phox mRNA转录和蛋白水平均升高。MDA、SOD水平增加。KEAP1表达持续降低,而Nrf2和HO-1表达上调,表明抗氧化系统被激活。NAC预处理的细胞迁移率(32.33±6.13%)、侵袭数(352.00±41.41个)和克隆形成率(230.67±12.04%),分别低于TCE诱导组(47.67±6.13%)、(644.00±39.23个)和(484.00±16.57%)。裸鼠成瘤实验中,NAC预处理组成瘤率为20.00%,低于TCE诱导组(40.00%),且新生物生长速率、终点体积(173.54±26.39 mm3)和Ki-67阳性细胞数都不及TCE诱导组。

(2)蛋白质定量和KEGG分析发现THLE-2-TCE细胞TGFβ、AKT、NFκB等分子显著上调。NFκB si RNA细胞克隆形成、侵袭和迁移能力降低,增殖蛋白cyclin D1表达增加。此外,AKT抑制剂MK-2206和TGFβR抑制剂LY364947处理后,THLE-2-TCE细胞内AKT和NFκB的表达明显下调。TGFβ1刺激后THLE-2细胞内AKT和NFκB表达呈浓度依赖性上调。NAC预处理抑制TGFβ/AKT/NFκB通路活化。

以上结果表明ROS可能通过调控TGFβ/AKT/NFκB信号轴参与TCE诱导的恶性转化。

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