人结直肠腺癌细胞的培养操作步骤及应用！

                    人结直肠腺癌细胞的培养操作步骤及应用！

一、背景

人结直肠腺癌细胞分离自直肠原位癌。人结肠癌Caco-2细胞系在标准培养条件下汇合后，自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型。当长到满时，细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白II，并呈角质蛋白阳性。

二、人结直肠腺癌细胞的培养

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM基础培养基78%

优质胎牛血清20%

P/S青霉素-链霉素1%

MEMNEAA非必需氨基酸1%

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

1）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

三、应用

人结直肠腺癌细胞可以用于大黄附子有效成分配伍在Caco-2细胞模型上的跨膜转运研究：

研究大黄酸、大黄素、去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱,以及大黄酸、大黄素分别与去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱配伍后在人结直肠腺癌细胞(Caco-2)细胞模型上转运过程,并探讨其配伍机制。

方法：以大黄酸、大黄素、苯甲酰乌头原碱、去甲乌药碱在Caco-2细胞上的累积转运量还有表观渗透系数Papp值为指标,采用高效液相色谱法(HPLC)对大黄酸、大黄素、去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱的含量进行检测,考察大黄酸、大黄素、去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱在Caco-2细胞上的转运行为,以及大黄素、大黄酸、与去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱分别配伍后转运行为的变化。

通过免疫荧光PCR方法检测大黄素、大黄酸与去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱配伍后对Caco-2细胞中外排转运蛋白:乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(Pgp)、多耐药相关蛋白(MRP2、MRP3)基因表达的影响。通过western-blot方法检测大黄素、大黄酸与去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱配伍后对Caco-2细胞中外排转运蛋白乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)、多耐药相关蛋白(MRP2、MRP3)蛋白表达的影响。

结果：去甲乌药碱Papp值均在1×10-7cm·s-1数量级,外排与吸收比值约为1.5,配伍大黄酸、大黄素后其Papp值均显著性上升(P<0.05)。苯甲酰乌头原碱配伍大黄酸后Papp值显著性上升(P<0.05),苯甲酰乌头原碱配伍大黄素后Papp值显著性下降(P<0.05)。

大黄素配伍苯甲酰乌头原碱后Papp值显著性上升(P<0.05)。大黄素配伍去甲乌药碱、乌头碱后Papp值显著性下降(P<0.05)。大黄酸配伍去甲乌药碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱后Papp值显著性下降(P<0.05)。去甲乌药碱促进外排转运蛋白BCRP、MRP2的表达,抑制P-gp的表达。

配伍大黄酸后抑制P-gp的表达;配伍大黄素后抑制Caco-2中MRP2和BCRP的表达。苯甲酰乌头原碱可以促进BCRP、MRP2的表达,抑制MRP3的表达;配伍大黄酸后,下调MRP2、BCRP的表达。大黄酸可以抑制BCRP的表达量;配伍去甲乌药碱后,MRP2的蛋白表达量上调;大黄酸配伍苯甲酰乌头原碱后,促进BCRP的表达,下调MRP3的表达。

大黄酸配伍乌头碱后,诱导MRP2、BCRP的表达。大黄素诱导了MRP3和BCRP的表达。配伍去甲乌药碱后,促进MRP2的表达。配伍苯甲酰乌头原碱后P-gp外排。配伍乌头碱后,诱导了MRP2的外排作用。

结论：大黄通过增加附子中水溶性成分和单酯型生物碱的吸收来增加附子的治疗作用,而附子通过降低大黄蒽醌的吸收来降低大黄的寒性物质基础,减轻大黄对人体的副作用。其作用机理与各个成分对外排转运蛋白P-gp、MRP2、MRP3或BCRP的抑制或诱导作用有关。

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