大鼠心脏微血管内皮细胞的技术背景与应用领域！

                   大鼠心脏微血管内皮细胞的技术背景与应用领域！

一、细胞简介

平台编号：Bio-73706

规格：1×10⁶Cells/T25培养瓶

细胞信息：原代细胞

细胞名称：大鼠心脏微血管内皮细胞

培养条件：原代细胞取组织现分

用途：研究

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、细胞详述

心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。

微血管内皮细胞呈单层覆盖于微血管表面，构成血管内外物质交换的一种重要屏障，是循环血流动力和血液中危险因素的主要靶点。

三、细胞特性

1）组织来源于实验动物的正常心脏组织。

2）细胞鉴定：vWF免疫荧光染色为阳性。

3）经鉴定细胞纯度高于90%。

4）不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5）细胞生长方式：多角形细胞，贴壁培养。

四、产品的运输和保存

视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

五、产品使用

1)本产品仅能用于科研

2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核

3)本产品未通过用于活体诊断的审核

六、技术背景

大鼠心脏微血管内皮细胞分离自心脏组织；心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是为血液流动提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏由心肌构成，左心房、左心室、右心房、右心室四个腔组成。左右心房之间和左右心室之间均由间隔隔开，故互不相通，心房与心室之间有瓣膜（房室瓣），这些瓣膜使血液只能由心房流入心室，而不能倒流。

心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。心脏微血管内皮细胞是组成心脏微血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在心脏血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。

近年来大量研究表明，心肌微血管内皮细胞的功能和病理改变直接影响心肌细胞功能，也是诸多毒素、炎症因子及病毒等重要靶位，其作为体外研究的细胞模型在心肌缺血-再灌注发病机制和细胞间旁分泌细胞生长因子研究中起着重要作用。大鼠心脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经CD31/vWF免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养：用1～4d sd大鼠全身经体积分数75%的酒精消毒后，仰卧位固定于无菌操作台上(以下步骤均为无菌操作。开胸，剥离心包膜，取心脏下1/3，置于盛有预冷(4℃pbs的小瓶中，洗尽血液，浸入体积分数70%的乙醇中10s以灭活心外膜和心内膜内皮细胞。预冷pbs冲洗，剪碎心肌组织，加入10倍体积的质量分数0.1%的胰蛋白酶，37℃消化5min。

轻轻吹打，静置1min后吸取上层液体(为分离出的内皮细胞(余下组织块用质量分数0.1%胰蛋白酶再消化5min，再收集上层液体用预冷的含体积分数15%小牛血清的培养基灭活残留胰酶活性。1000r/min，4℃离心10min收集细胞。将细胞重悬于含体积分数20%小牛血清m199培养基(内含100u/l青霉素、100mg链霉素、10mmol/l hepes、2mmol/l l_谷氨酰胺，200目筛网过滤，得到细胞混悬液，接种于培养瓶中，37℃培养30min以使成纤维细胞贴壁(重复此操作可提高细胞纯度。

转移细胞悬液，混匀后计数，根据实验目的不同，调整细胞密度至合适浓度，接种于培养瓶、96孔培养板或放有盖玻片的6孔培养板内(预先用质量分数1.5%的明胶处理，放入37℃，体积分数5%的co2培养箱中孵育6h，去除未粘附细胞，再放入m199(质量浓度50mg/l肝素、质量浓度15mg/l ecgs、体积分数20%的胎牛血清完全培养基中培养。co2培养箱37℃培养，24h后换液1次，以后每2～3d换液1次，直至长成细胞单层，用质量分数0.125%的胰蛋白酶消化备用。细胞存活率用锥虫蓝染色判断。

七、应用领域

大鼠脑微血管内皮细胞原代培养可用于：（1）血脑屏障的研究；（2）脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究；（3）新药筛选；（4）脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究。

制备多组大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型,通过显微镜对细胞形态进行观察,为后续实验提供形态学依据。探讨乌司他丁(UTI,Ulinastatin)预处理对LPS诱导损伤心肌微血管内皮细胞相关炎性反应的影响。

选取大鼠心肌组织,用PBS液洗除血液,同时对大鼠心脏细胞进行培养,直至长成细胞单层,选第3代内皮细胞,0.25%胰蛋白酶消化后将上述细胞分成6组:(1)空白对照组:加入无血清培养基;(2)模型组1:加入含0.01μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(3)模型组2:加入含0.1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(4)模型组3:加入含1μg/mlLPS的无血清培养基作用24h;(5)模型组4:加入含10μg/ml LPS的无血清培养基作用24h;(6)模型组5:加入含100μg/mlLPS的无血清培养基作用24h。

在倒置显微镜下、扫描显微镜及透射显微镜下观察孵育前和孵育24h后内皮细胞形态学改变情况。对于大鼠心脏微血管内皮细胞脂多糖损伤模型进行继续培养干预:1)对照组不做任何处理;2)阿托法他汀(10000u/ml)预处理组;3)低浓度(5000u/ml)乌司他丁预处理组;4)中浓度(10000u/ml)乌司他丁预处理组;5)高浓度(20000u/ml)乌司他丁预处理组。

通过免疫组化以及Western blot等检测方法对处理前后各组细胞进行炎性因子检测,具体指标包括白细胞介素(IL-1)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞自噬相关蛋白Atg5,Beclinl和LC等在细胞内的表达情况;后期进行数据总结和分析;通过Western blot法检测各组内皮细胞中Bcl-2、bax蛋白表达水平的变化;MTT法检测各组细胞活力;流式技术检测各组细胞凋亡率。

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